鼠尾基因型快速鉴定试剂盒

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1、碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线：400-168-3301或800-8283301 订货e-mail： 技术咨询： 网址：http:/ 碧云天网站 微信公众号 鼠尾基因型快速鉴定鼠尾基因型快速鉴定试剂盒试剂盒 产品编号 产品名称 包装 D7283S 鼠尾基因型快速鉴定试剂盒 100次 D7283M 鼠尾基因型快速鉴定试剂盒 500次 产品简介：产品简介： 碧云天生产的鼠尾基因型快速鉴定试剂盒，也称小鼠基因型快速鉴定试剂盒(鼠尾)(Quick Genotyping Assay Kit for Mouse Tail)可以从鼠尾、鼠耳(mouse ear)或其它

2、组织快速提取和PCR扩增基因组DNA，以用于小鼠基因型鉴定(genotyping)等。试剂 盒提供了Easy-Load PCR Master Mix (Blue, 2X)，PCR更便捷，PCR结束后可以直接上样电泳。 本试剂盒能快速消化鼠尾组织样品获得基因组DNA，无需机械破碎、有机萃取、柱纯化和DNA沉淀，鼠尾基因组DNA抽提 的过程仅需约20分钟。 本试剂盒适用于小鼠等的基因型鉴定(genotyping)，提供了小鼠基因型鉴定的对照引物，产物大小为299bp。 本试剂盒中提供的Easy-Load PCR Master Mix (Blue, 2X)中含有2X Taq DNA Polymera

3、se，2X PCR Buffer，2X dNTP和2X上 样缓冲液，只需加入适量引物、模板和水即可进行PCR扩增，大大简化了PCR操作，减少了PCR操作过程中可能导致的污染。 PCR完成后可以直接上样电泳，无需再添加上样缓冲液。 使用本试剂盒进行PCR检测时仅需极少量的样品就能完成目的基因的扩增和分析。 使用本试剂盒提取的小鼠尾巴基因组DNA直接PCR的效果可参照图1。 图1. 本试剂盒提取的小鼠尾巴基因组DNA直接PCR后的电泳图。PCR反应使用的引物是根据小鼠GAPDH和HSP70基因序列 进行设计的，泳道1(GAPDH)和2(HSP70)的PCR产物大小分别为299bp和403bp。M,

4、 marker。 对于20微升的PCR反应体系，本试剂盒的两种包装分别可用于100个或500个鼠尾样品的基因型鉴定。 包装清单：包装清单： 产品编号 产品名称 包装 D7283S-1 DNA Extraction Solution 9.6ml D7283S-2 Enzyme Mix 0.4ml D7283S-3 Stop Solution 10ml D7283S-4 Easy-Load PCR Master Mix (Blue, 2X) 1ml D7283S-5 Control Primers for Mouse GAPDH (10M each) 20l 说明书 1份 产品编号 产品名称 包装

5、 D7283M-1 DNA Extraction Solution 48ml D7283M-2 Enzyme Mix 2ml 2 / 4 D7283 鼠尾基因型快速鉴定试剂盒鼠尾基因型快速鉴定试剂盒 400-1683301/800-8283301 碧云天碧云天/Beyotime D7283M-3 Stop Solution 50ml D7283M-4 Easy-Load PCR Master Mix (Blue, 2X) 5ml D7283M-5 Control Primers for Mouse GAPDH (10M each) 100l 说明书 1份 保存条件：保存条件： -20C保存，一

6、年有效。DNA Extraction Solution和Stop Solution可以4C保存，3个月内有效。 注意事项：注意事项： 使用本试剂盒消化小鼠尾巴或其它组织样品时，一定要确保组织样品充分浸没在消化液中。 配制消化液时，DNA Extraction Solution和Enzyme Mix混匀后，应尽快使用，放置太久可能会影响DNA抽提效果。 由于PCR反应非常灵敏，可以扩增目的基因片段超过1000万倍，在使用Taq酶时请注意避免微量待扩增DNA的污染，并尽量 考虑设置不加模板的空白对照以确认是否有待扩增DNA的污染。 本试剂盒中的Easy-Load PCR Master Mix (B

7、lue, 2X)经过15次反复冻融后仍具有和冻融前几乎相同的PCR扩增效果， 但仍宜 适当避免过多的反复冻融，并且在使用前，一定要完全融化，并上下颠倒轻轻混匀后才能使用，并尽量避免起泡。 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明：使用说明： 1. 小鼠尾巴小鼠尾巴、动物组织动物组织、头发或唾液基因组头发或唾液基因组DNA的提取的提取 a. 消化液的配制：按照样本数量配制消化液，具体配制方法如下： 试剂 1个样品 10个样品 DNA Extraction Solution 9

8、6l 960l Enzyme Mix 4l 40l 注：消化液需现配现用，并需要在充分混匀后使用。 b. 不同组织样品基因组DNA的提取。 (a) 新鲜或冻存的小鼠尾巴：新鲜或冻存的小鼠尾巴：实验前用70%的乙醇冲洗剪刀和镊子。剪取0.2-1cm的小鼠尾尖置于上述配制好的100l消化 液中，需确保小鼠尾巴完全浸没在溶液中(一般情况下，重量约为15mg的1cm长的小鼠尾尖刚好能浸没在含有100l 消化液的PCR管中，小鼠尾巴的重量不宜超过15mg)。对于新鲜的小鼠尾巴，建议尽量在剪下鼠尾后30分钟内进行基 因组DNA抽提，否则宜尽快冷冻存放。 (b) 头发：头发：实验前用70%的乙醇冲洗剪刀和镊

9、子。剪除头发的多余部分，仅需保留头发的根部区域并将其置于上述配制好 的100l消化液中，每次提取只需一根带根部的头发。 (c) 唾液：唾液：吸取10l的唾液加入上述配制好的100l消化液中，涡旋或移液枪吹打混匀。 c. 将样品置于55C水浴或PCR仪，孵育15分钟。 d. 将样品置于95C水浴或PCR仪，孵育5分钟(孵育结束后组织未完全消化属于正常现象，不会影响试剂盒的检测效果)。 e. 向上述样品中加入100l的Stop Solution，涡旋混匀。 f. 将上述提取样品置于-20C或4C保存或立即进行PCR检测(若需长期保存样品，应将未消化的组织去除或将提取物转移到 新的离心管中。大部分情

10、况下，提取物4C能保存至少1个月，-20C至少能保存一年)。 2. PCR扩增扩增 a. PCR反应体系的设置： (a) 融解并混匀PCR反应所需的各种溶液。将Easy-Load PCR Master Mix (Blue, 2X)置于冰浴上或冰盒内。 (b) 参考下表在冰浴上配制PCR反应体系： 试剂 最终浓度 体积 双蒸水或Milli-Q水 - 7.4l 模板(消化产物) 2-20ng/l 1l 引物混合物(10M each) 0.8M 1.6l Easy-Load PCR Master Mix (Blue, 2X) 1X 10l 总体积 - 20l (c) 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vor

11、tex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。 (d) 如果所使用的PCR仪有热盖则省略本步骤。如果PCR仪没有热盖，则在管内滴入一滴矿物油(mineral oil，ST275)。 (e) 把配制好的PCR反应体系置于PCR仪上，开始PCR反应。 b. PCR反应参数的设置可以参考如下示例： Step Temperature Time Cycles 起始变性 94C 3min 1 变性 94C 30sec 30-35 退火 55C 30sec 碧云天碧云天/Beyotime 400-1683301/800-8283301 D7283 鼠尾基因型快速鉴定试剂盒鼠尾基因型快速鉴定试剂盒 3 / 4

12、延伸 72C 1kb/min 最终延伸 72C 10min 临时保存 4C forever - 3. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 PCR反应结束后直接上样进行琼脂糖凝胶电泳。 常见问题：常见问题： 1. PCR产物少或没有目的条带。产物少或没有目的条带。 a. 组织提取物中的污染物抑制了PCR反应。为检测抑制物，可用等体积混合的DNA Extraction Solution和Stop Solution，同 时用DNA对照或已知数量的模板(100-500 copies)进行PCR反应。 b. 组织消化不够充分。可适当延长55C消化时间或适当增加Enzyme Mix的使用量。 c. Enzyme

13、 Mix未被完全灭活。适当延长消化产物在95C的孵育时间。 d. 引物设计不佳是PCR过程中最常见的问题。请选择适当的引物设计软件进行引物设计，注意引物的GC含量、二级结构、 二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。在加入酶切位点等的引物中，一定要注意加入酶切位点等后整条引物 的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。在原有引物效果不佳的情况并且阳性对照引物 可以正常工作的情况下，可以考虑更换引物。 e. 待扩增片段GC含量偏高。GC含量较高的情况下PCR会变得相对比较困难，此时可以使用适合扩增高GC含量DNA片段的 GC-rich buffer，并相应地根据GC-

14、rich buffer的要求或说明调整PCR反应参数的设置。 f. 长片段扩增。尽管Taq DNA polymerase可以扩增最长达8kb的DNA片段，但大多数时候比较适合扩增2-3kb以下的片段， 更长片段的扩增推荐使用其它更适合长片段扩增的DNA聚合酶。 g. PCR反应设置时在室温进行容易导致非特异性条件。推荐在冰浴上设置PCR反应。 h. 由于引物存在一定的二级结构或存在一定的引物二聚体，或引物偏短，导致退火效果不佳。此时可以采用Touch down等 方法进行退火，通常采用从65C逐步缓慢降温到55C或50C的方法，使退火更加充分。 i. 退火温度不佳，需要优化。如果有温度梯度PC

15、R仪，则可以设置退火的温度梯度，摸索退火的最佳温度。如果没有温度 梯度PCR仪，则可以通过多次PCR反应摸索最佳的退火温度。 j. 延伸时间不足。可按照每1kb片段延伸1分钟进行设置，对于较难扩增的片段可以设置为每1kb片段延伸1.5-2分钟。 k. 待扩增片段GC含量较高或长度较长，变性不够充分。可以调节起始变性条件至95C 1min甚至95C 2-4min。 l. 在不同PCR仪上进行PCR反应，避免有时PCR仪出现问题。 m. 循环数不足，适当延长PCR的循环数。通常循环数最高不必超过40，常用的循环数范围为25-35。 n. 模板含量太低，适当加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即为在原先设计的PCR引物内侧再 设计一对PCR引物，然后对第一次PCR产物进行稀释后再进行一次PCR扩增，这样一方面可以起到扩增作用，同时也可 以从第一次PCR产物中扩增出特异性条带。二次PCR则为比较简单地用原有引物对第一次PCR产物进行稀释后再进行一 次PCR扩增，可以起到扩增作用，但不能去除非特异性条带。 o. 注意设置适当的阳性对照和阴性对照通常会有很大帮助。 2. 组织在孵育后未组织在孵育后未完全完全消化。消化。 a. 有些组织很难完全消化。碧云天生产的直接PCR试剂盒不要求组