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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 基因转染肝细胞癌 SMMC-7721 克隆筛选及鉴定作者：谷燕娇, 高志安，苏荣健 作者单位：1.辽宁医学院附属第一医院病理科;2.辽宁医学院科学实验中心，辽宁 锦州【摘要】 目的 用 Grp78 基因转染人肝细胞癌 SMMC-7721，筛选阳性克隆并鉴定。方法 利用真核表达载体pcDNA3.1+Grp78 转染 SMMC-7721，pcDNA3.1+Grp78 与转染试剂的比例(g/L)分别为23、24、25、26、27、28、29， 400 g/mL G418筛选阳性克隆后，传代扩增，Western Blot 鉴定克隆的 Grp78 表达情况。应用
2、 pcDNA3.1 空载体作为阴性对照。结果 Western Blot 显示，转染后的 SMMC-7721 经 G418 筛选，除一个克隆不高表达外，其余克隆均高表达 Grp78。结论 Grp78 转染 SMMC-7721 的最佳转染效率是 82(转染试剂/DNA)，由于假阳性克隆的存在，筛选后的克隆需要鉴定。【关键词】 Grp78;基因转染;克隆筛选Selecting and Verifying SMMC-7721 Clones Transfected by Grp78 GeneGU Yanjiao1, GAO Zhian1 ,SU Rongjian2(1.The Pathology Dep
3、artment of the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University;2.Central Laboratory of Liaoning Medical University, Jinzhou KKME-专业医学搜索引擎 http:/ China)Abstract：Objective This paper is to transfect Grp78 gene to SMMC-7721, select high Grp78 expression clone, and verify. Methods Using pcDNA3.
4、1+Grp78 to transfect human hapatocellular carcinoma SMMC-7721, pcDNA3.1 as control, DNA: Fugene HD (g/ L) is 23， 24， 25，26，27，28，29 and selecting positive clones by G418(400 g/mL), amplifying, then verifying them by WB. Results Western Blot indicates that SMMC-7721 transfected by Grp78 gene could hi
5、gh express Grp78. Conclusions The optimized transfection efficiency of Grp78 transfecting SMMC-7721 is 82(Fugene HD/DNA), as the existence of false positive clones, we need to verify all clones before using them.Key words： Grp78; gene transfection; clone selectingGrp78(葡萄糖调节蛋白 78)是内质网合成和分泌的一种多功能蛋白质，
6、它是热休克蛋白 70 家族(HSP70)的一员。在细胞的分化、生存、应激反应、血管的形成、肿瘤的发生等方面都发挥着重要的作用1-3。最近研究发现，下调其表达可以抑制肿瘤细胞的侵袭和转移能力4。为进一步研究 Grp78 在肝细胞癌侵袭和转移方面的作用，我们用 Grp78 的真核表达载体转染 SMMC-7721，筛选高表达克隆，鉴定。1 材料与方法1.1 材料人肝细胞癌 SMMC-7721，购至于中科院细胞库。转染试剂 KKME-专业医学搜索引擎 http:/ HD)和 G418 购至于沈阳联星。Grp78 抗体，购至 Santa Cruz。1.2 细胞培养用含 10% 胎牛血清、100 IU/m
7、L 青霉素、100 g/mL 链霉素的 DMEM 培养基培养。每 3 天换 1 次液，细胞 80%融合后传代，用含 0.25%胰蛋白酶和 0.02%的 EDTA 的消化液消化细胞。1.3 人 Grp78 基因表达载体的构建2007 年，已经成功地构建完成5。1.4 SMMC-7721 细胞 G418 最小致死剂量筛选用 96 孔板接种 SMMC-7721，细胞密度 80%，贴壁 24 h 后，加入含 G418 分别为 100、200、300、400、500、600、700、800 g/mL 的浓度。每 3、4 天换液 1 次，观察时间由细胞的死亡程度决定(一般 1 个月) 。筛选致死 SMMC
8、-7721 的最少剂量作为以后筛选克隆细胞使用。1.5 pcDNA3.1+Grp78 转染 SMMC-7721选取 30 代以内的细胞做转染。1.5.1 SMMC-7721 接种于 6 孔板(或平皿)，细胞密度 70%左右，每孔 2 mL 完全培养液 (无抗生素);1.5.2 配制转染试剂：按照每孔 2 g DNA/100L DMEM配制 DNA 稀释液,加入 EP 管。分别按照 DNA 与转染试剂(g/L)体积比 32,52,82 将 Fugene HD 垂直加入 EP 管中，混合均匀，室温静置 30 min，对照组转染空载体 pcDNA 3.1;KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 细
9、胞贴壁 24 h 后转染，不用更换培养液，直接垂直加入配好的转染试剂(32,42,52,62,72,82,92);谷燕娇，等：Grp78 基因转染肝细胞癌 SMMC-7721 克隆筛选及鉴定辽宁医学院学报 2008 年 10 月，29(5)1.5.4 加入转染试剂后，混合均匀，放入培养箱中培养。1.6 G418 筛选2448 h 后，首次换液，加入 G418 的最小致死剂量。之后每 3、4 天换液，加 G418。注意防止污染。直到形成单个克隆。1.7 克隆培养G418 筛选后的克隆细胞，分别挑空载体 pcDNA3.1 和pcDNA3.1+Grp78 至 96 孔板中，继续加入最小致死剂量的 G
10、418 培养。标记好克隆的编号，待克隆细胞长满 96 孔板后，传至 24 孔板，待其再长满传至 6 孔板和 25 cm2 培养瓶中，之后加入半量 G418 最小致死剂量培养克隆细胞。1.8 克隆鉴定克隆细胞的鉴定，通过 WB 方法鉴定。分别将转染pcDNA3.1 和 pcDNA3.1+Grp78 的克隆编号后，用细胞刮刀刮下，收集至 EP 管内。用 TBS 漂洗后加入 RIPA 缓冲液(1%NP 40，0.5% 脱氧胆酸钠，1%SDS，0.1%PMSF)裂解细胞，考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。加热变性，SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜， 5% 脱脂奶粉封闭过夜，加入 11 000 倍稀释的一抗
11、Grp78，杂交 2 h，-actin 作为内参。TBST 洗膜后加入二抗温育 1 h，TBST 洗膜后进行KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 显色，采用 Chemi-genius 凝胶成像系统分析目的蛋白的表达量。2 结 果2.1 形态学观察每天观察 G148 不同浓度的 SMMC-7721 死亡情况，确定400 g/mL 是最佳的浓度。如图 1 所见，可见转染后的细胞的克隆。2.2 克隆细胞计数 1.转染 pcDNA3.1+Grp78 的克隆;2. 转染pcDNA3.1 的图片，40 倍;3.转染 pcDNA3.1+Grp78 的克隆，100 倍图 1 转染后克隆形成图片由表 1 可
12、见，转染试剂与转染质粒的比例以 82 最好。表1 克隆形成的个数与 HD/转染 DNA(g/ L)之间的关系HDDNA32425262728292 克隆形成数101116202530222.3 Westren Blot 鉴定如图 2 所示，高表达 Grp78 细胞克隆的 Grp78 表达量几乎是 SMMC-7721 细胞 Grp78 表达量的三、四倍。由图 3 可见，转染空载体的克隆细胞与 SMMC-7721 的 Grp78 表达情况相近，均比Grp78 转染后的克隆表达 Grp78 水平低。上图为 beta-actin 结果，下图为 7 个克隆与 SMMC-7721 的 Grp78 表达情况
13、3 讨 论基因转染技术是将纯化的含有靶基因的质粒 DNA 或 RNAKKME-专业医学搜索引擎 http:/ DNA 必须无蛋白质，无 RNA 和其他化学物质的污染，OD260/280 比值应在 1.8 以上。本试验用 pcDNA3.1 做载体，转染 Grp78 基因进入人肝细胞癌 SMMC-7721 细胞株，48 h 后用 G418 筛选阳性克隆细胞。结果显示，我们选用的 pcDNA3.1+Grp78 转染效果很好，通过观察形成克隆个数的多少，认为最佳的转染比例为 82，即 8 L 转染试剂：2 g DNA。细胞转染的效率的多少与转染试剂和转染 DNA 的比例有关，一般按照 2 g DNA
14、与转染试剂 3、4、5、6、7、8、9L作为初步试验，如果转染后的克隆数比较少，可以进一步增加转染试剂以得到更多的克隆细胞。转染试剂对细胞是有一定的毒性的，根据细胞的差异而不同。故而，也不是转染试剂越多转染的细胞率越高，比例合适的转染效率才是最好的。鉴定转染基因进入细胞的鉴定，我们应用 Western Blot 技术(蛋白印迹技术) ，因为 Grp78 转染进入细胞后在蛋白质表达上，理论上会高表达 Grp78。转染成功的 SMMC-7721 一定高表达 Grp78蛋白，相反，转染失败的克隆，一定不会高表达 Grp78，弃掉。然而，由于在细胞株中，有一些自然抗 G418 的细胞，在 400 g/
15、mL的 G418 作用下，这样的细胞也会存留下来，因而，在挑克隆的时候，一定要注意挑单个的克隆，不要混杂周围的不明细胞，确保它们是来自于一个细胞的克隆细胞群。这样在用 Western Blot 鉴定细KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Grp78 的SMMC-7721 时，可以认为它们是高表达的，当鉴定结果为非高表达的 Grp78 的 SMMC-7721 时，可以认为它们只是具备抗 G418 特性的克隆，而不是我们需要的阳性克隆。一般筛选细胞克隆都需要筛选10 个以上，以备有的克隆株突然丢失了转染的基因片断而影响到下一步的试验。因而，我们需要鉴定并冻存阳性克隆细胞。在以后使用复苏的高表达 Grp78 的 SMMC-7721 时，都需要加入半量的 G418 作为维持剂量，以抑制少量的非高表达 Grp78的细胞生长超过高表达 Grp78 的克隆细胞。综上所述，pcDNA3.1+Grp78 转染人肝细胞癌 SMMC-7721的最佳的转染比例是 82(L/g)，获得了高表达 Grp78 的细胞株。经 W
