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1、浙泼大学硕士学位论文喜树碱对结肠癌细胞诱导性一氧化氮合酶合成的影响浙江大学医学院病理教研室2 3 级研究生沈香娣嚣师陈增良教授中文摘要喜树碱，是一种从喜树的枝予中提取的生物碱，被认为是一种有效的抗肿瘤药物。其抗肿瘤谱广泛，抗肿瘤作用的原理复杂，其中最主要的是因为其作为拓扑异构酶l 抑制剂而抑制D N A 的合成。近来，有新的研究发现，其抗肿瘤的效应还可能和其他作用途径有关，比如抑制血管生成，诱导肿瘤细胞凋亡等。许多研究表明诱导性一氧化氦合酶( i N O S ) 在肿瘤的生长、侵袭和转移过程中超相当重要的作用。在许多实体肿瘤中，i N O S 过度表达。而且，i N O S 的活性也和肿瘪的分
2、级和细胞的分化有密切的关系。近来有研究显示，喜树碱能影响病毒转染的鼠臣噬细胞样细胞系R A W 2 6 4 7 的i N O s 摄白质的表达和活性。而喜树碱是否能影响肿瘤细胞i N O S 的表达，国内外尚无报道。本实验通过观察喜树碱对人结肠腺癌s 、矾8 0 细胞系一氧化氮( N 0 ) 的产量、i N O sn 1 I A 和蛋白质表达的影响，探讨喜树碱抗肿瘤效应的可能的相关机制。实验方法l 。S w 4 8 0 细胞的培养( 1 ) 常规传代培养生长至对数生长期的S W 4 8 0 细臆经胰蛋妻l 酶溃化厩以一传三的比例接辣于l O Om L 培养糕中，放入3 7 、5 c 0 2 的
3、细飓培养箱培养，细艟贴壁盾小心弃去旧培养基，每瓶加新鲜的D M E M 培养纂i O 毪儿继续培养，以备实验使用。( 2 )实验细胞的猴各测定N O 生成量的实验细胞准备浙江大学硕士学位论文将生长至对数生长期的S w 铝O 细胞经胰蛋自酶消化后，以约2 0 l 酽个，孔接弛于9 6 孔培养板中，放入3 7 、5 c 0 2 的细胞培养箱培养1 2 小时，细胞贴壁后小心弃去旧培养基，每孔加2 0 0 此含1 0 新生小牛血清( B C s ) 、l O 肛g ，I ，的脂多糖( L P s ) 、2 0n g ，L 的自介素l p ( I L i p ) 的D M E M 培养基，加入不同终浓度
4、的喜树碱溶液分别作用与上述细胞。测定i N O sI n I 矾A 和蛋白生成量的实验细胞准备将生长至对数生长期的s w 4 8 0 细胞消化后以2 1 0 6 ，瓶的细胞数培养，放入3 7 、5 C 0 2 的细胞培养箱培养1 2 ，J 、时，缨胞贴壁后小心弃去f 匿培养基，每瓶加l O m L 含1 0 B C S 、1 0 州L 的L P S 、2 0 1 1 9 L 的I L - l p 的D M E M 培养基，将终浓度为O 1 2 5p 咖n L 、O 2 5 “咖L 的喜树碱加入上述准备的细胞作用2 4 小时。2 喜树碱对S W 4 8 0 细脆N 0 生成量的影响( 1 ) 取
5、5 0 、1 0 0 、1 5 0 、2 0 0 # m o U L 的N 烈0 2 各1 0 0 虬，加G r i e S S 试剂，青4得标准曲线，计算标准方程。( 2 ) 按前述准备的细胞分剐培养1 8 小时、2 4 小时，用G r i e s s 法测N O 的生成量，同时用M r r 法测细胞的存活率。3 喜树碱对S 、张8 0 细胞i N O sm R N A 表达的影响按1 H z l o 试剂盒说明一步法提取S w 4 8 0 细胞的总R N A ，用紫外线分光光度计测定R N A 的纯度并定量。取总R N A 进行逆转录，然盾再进行P C R 反应，反应产物在1 5 琼脂糖凝
6、胶上电泳，应用凝胶扫攒仪对电泳带进行吸光度扫描，并以G A P D H 校正做相对量分析，数值以两者积分吸光度的比值表示。4 喜树碱对S w 4 8 0 细脆i N O S 蛋白质表达的影晌将实验s w 4 8 0 细胞消化离心后加蛋白裂解液提取总蛋白，测定蛋白浓度，上样，电泳，然后转移样品至硝酸纤维素膜上。封闭，加一抗、二抗杂交，用H R P E C L发光法检测，见淡绿色荧光条带，将膜固定予胶片盒中，曝光后显影，定影。应用凝胶扫描仪对胶片条带进行吸光度扫描，并以p a c t i n 校正做相对量分析，数值以两者积分吸光度的比值表示。2 浙江大学硕士学位论文结果1 G r i e s s
7、反应梭测得到的皿硝酸盐的标准方程c ( 岬0 1 ，】0 = 4 1 2 4 4 训。2 0 7 3 lF = O 9 8 72 喜树碱对S W 4 8 0 细胞N O 生成量的影响O 0 3 2 瑚m L 、O 1 2 5 扯g m L 、O 5 “劝m L 、1p g ，m L 、2 l g ，m L 的喜树碱作用于加有细胞因子的S w 4 8 0 细胞1 8 小时，细胞存活率实验组和对照组无明显差别( P O 0 5 ) ，2 腿脑L 的喜树碱组N O 生成艟与对照组相比有显著差异( P 0 0 5 ) H o w e v e r ，s i 鲥矗c a n td 主摄牝n c e 、张s
8、o b s e r v e da ta l lc o n c o n 柏_ t i o n sa 矗e r2 4 小奴m b 撕o n A d 虢i o 嘲l y ，t 量l c r ew a sn os i 蛐f i c a n td i 虢r 髓c eo nc e l ls u i 诃r a t ea m o n gc c l l st r e 曲咀b yv e h i c l ea 1 1 d0 0 3 2 “m L 、O 。1 2 5 腿，n l LC P T 3 E 艉c to fC P ，ro ni N o Sm R N Ae x p r e s s i o nn 、a ss u
9、g g e s t e dt h a t 也e r ew a ss i 蛆i 矗c a I l td i 鼢e n c ea m o n gi N O Sm R N Ao fS W 4 8 0 捃e a t c db yC P T ( 。0 3 2 悖链，、O i 2 5 弘跏也)鞠de o n 细lf o r2 4i l o 粥( 尸 1 0 6 个) 各加入ln l u h z o l ，充分混匀，室温5 分钟。( 3 ) 加入2 0 0 此氯仿，劂烈振荡混匀3 0 秒。( 4 ) 台式离心机上，1 2 ，0 瑚p ，室温离心5 分钟。，1 6 浙江大学硕士学位论文( 5 )将上清液小心转
10、移到R n a s e 矗e e1 5 m L 离心管里室温下放置5 分钟。螽式离心梃上，1 2 ，o O O 蹦p ，室溉离心5 分铮。小心移去上清液，防止R N A 沉淀丢失。糟7 0 乙醇洗涤两次，每次7 0 0 汕，1 2 ，0 0 0r m p ，尽可能彻底娩吸走上溃，防止黜姨沉淀丢失。放在室温下使乙醇完全挥发。加入等体积的昴丙醇，室温离心2 分钟。沉淀用3 0 一5 0 肚D E P c H 2 0 溶解。分装，- 7 0 保存。紫外线分光光度计测O D 2 和0 现s 。篷，计算所提取的R N A 豹纯度和总爨，0 D 2 6 眈s 0 在1 8 以上符合R N A 纯度要求。2
11、 逆转录( R T ) 反应敬R N A 2p gR N Ao l i g o ( d T ) 1 8O 0 5 “g “L2 烬1 0u L7 0 5f n i n 冰浴褥按以下顺序加样至总体积2 5 此。M M L 5 R e a c t i o nB u 如r5 乩d 朋Z l O m M1 2 5 曲d G l B l O m M1 2 5 曲d T T P ，1 0 1 1 1 M1 2 5 肚Ld C T P 1 0 m M1 + 2 5 肛LR _ e c o m b i n a n tR n a s 瓤黜b o n u c l e 8 S cl n h i b i t o r2
12、 5u n t sM M E R T2 0 0u n i t sN u c l e a s e - F r c eW 玑e rt of i n a lv o l u m e2 5p L反应参数；4 2 6 0m i n ，9 5 l O 耐n ，4 保存。3 聚合酶链反应( P C R )1 7 i酏“ 鼬鲇mn!(1(浙江大学硕士学位论文( 1 ) 取经D E P c 水处理过的薄壁E p p e n d o r f 管一个，按以下顺序加样：T a q B 硼F c r1 0 5 此M g C l 22 5 m M4 吐d N T P1 0m Ml 止上游引物l O p m o l 啦l 江
13、下游引物1 0p m o l ，皿1 止c D N A2 5 此1 细酶5 “此1 儿牵 充水至5 0 此( 2 ) P c R 循环：9 4 3r n i n ，9 4 4 5s e c ，5 0 1m i n ，7 2 lm i n ，菇4 0 个循环，最屡7 2 7 m i n 4 保存。( 3 ) 三cG A P D H 的P C R 产物作为内对照。4 电泳扫描分板取1 0 此P C R 扩埔产物，1 5 琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后，应用凝胶扫攒仪慰电泳带进行吸光度扫接，并以Q 艚D H 较夔傲框对攫分辑，数僮以嚣者积分吸光度的比值表示。四、W E s T E R NB L o T
14、测定S W 4 8 0 细胞i N o s 蛋白的表达1 溶液与缓冷滚豹配制( 1 ) 3 0 储备胶溶液2 9g 丙烯歉胺粉末、ig 亚甲基双菇烯酰胺混匀后，翔楚3 7 d d H 2 0 溶鳃后，定容至1 0 0m L ，避光室温保存。( 2 ) 4 分离胶缓冲滚T 矗s1 8 1 7 9 加d d H 2 0 溶解，浓H C 】调p H 至8 8 ，定容至1 0 0 m L 。( 3 ) 4 浓缩胶缓冲液T r i s6 0 6g 加d d H 2 0 溶解，浓H C l 调p H 至6 8 ，定容至1 0 0 m L 。1 8 浙江大学硕士学位论文( 4 ) l O S D S 溶液电
15、泳级S D s1 0g 溶解于6 8 d d H 2 0 中，浓H C l 调p 王至7 2 ，定容至l O O m L ，室漩保存。( 5 ) 强i s 甘氨酸电泳缓冲液9 0 0 m L d d H 2 0 溶解1 5 1g n i s 和d d H 2 0 定容至1 L 。( 6 ) l O 过硫酸铵溶液O 1g 过硫酸铵粉末拥d d H 2 0 歪l( 7 ) 5 上样缓冲液9 4g 曹氨酸，加5 0 m L l O S D S 储存液，0 1 1 1 L ，4 保存，一周内使用。1 r i s H C l ( 1m o l L ，p H 6 8 )O 6m L甘油( 5 0 )5m
16、LS D S ( 1 0 )2n l L2 * 巯基乙醇O 5m L澳酚蓝( 1 )1m Ld d H ，OO 9 m L( 8 ) T B S 液N a C l4 4 3 7 5g1 1 r i s - H C l ( p H 7 5 )O 6 0 5 8gd d H 2 05 0 0 m L( 9 ) T B S T 溶液N a C l4 4 3 7 5gT r i s H C l ( p H 7 5 )O 6 0 5 8gd d H ，O5 0 0 m LT w e e n - 2 00 1 m L( 1 0 ) 封闭液N a C l4 4 3 7 5g1 9 -浙江大学硕士学位论文T r i s - H C 姬H 7 5 )O 6 0 5 8g越H 2 05 0 D m LT w e e
