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1、中山大学硕十学位论文氯乙烯致L 0 2 肝细胞蛋白质组差异表达的研究三氯乙烯致L 0 2 肝细胞 蛋白质组差异表达的研究专业：卫生毒理学硕士生：黄海燕指导老师：庄志雄教授，刘建军摘要三氯乙烯( t r i c h l o m e t h Y l e n e ，T C E ) 是工业上广泛应用的一种有机溶剂，主要用作金属表面脱脂剂、黏合剂、润滑剂、冷冻剂等。T c E 为不饱和卤代脂肪烃类化合物，易挥发，无色、有类似氯仿气味。职业接触T c E 的途径主要为吸入其蒸汽或经皮肤直接接触吸收。吸入的T C E 有5 0 6 0 储留于体内，进入血液循环后大部分在肝脏内被氧化成三氯乙酸、三氯乙醇和少量
2、一氯乙酸，并经肾脏随尿排出：小部分以原形经肺泡自呼出气中排出，其排出量为吸收量的1 9 。有部分T C E 和三氯乙酸尚留在人体组织中，长时问吸收以脂肪、脑和肾上腺中的含量最高，肝脏、心脏中也存在。T C E 具有三致( 致癌、致畸、致突变) 作用及免疫毒性，对肝脏、心脏及肾脏等实质脏器产生损害，并能引起严重的职业性药疹样皮判“。国际癌症研究署( I A R C ) 【2 J 在1 9 9 5 年对T C E 致癌性分类做了修改，将其对人类非致癌改为对人类可能致癌。近年来，国内外因职业接触T C E 而引起中毒的报道很多，如不及时采取适当措施，势必危害更多工人的健康，对社会和经济造成重大损失。
3、然而，针对三氯乙烯中毒尚无特效解毒剂，治疗主要以对症及支持疗法为主，使得针对性开展对T c E 中毒高危人群早期诊断及中毒机理的研究已经成为公共卫生和毒理学工作者迫切的任务。随着2 0 0 1 年2 月1 5 日人类基因组全序列草图的基本完成，人类基因组计划进入后基因组时代。在后基因组时代，研究的重点已从结构基因组学转移到功能基因组学，人类蛋白质组学的研究是揭示人类生命活动和疾病机制的最终阶段。任何一种疾病在其表现出任何可察觉的病症之前，肯定已经有某些蛋白质发生了中山人学硕十学位论文三氯乙烯致L 0 2B 下细胞蛋白质纽差异表达的研究变化，运用蛋白质组学技术寻找各种疾病的关键蛋白和标志蛋白，可
4、实现更加及时、准确的渗断，从而可最大限度的减少病人的痛苦，降低费用，挽救生命，甚至可在早期抑制疾病的发生p 】。目前T C E 具体的毒作用机制尚未十分明确，通过蛋白质组学技术研究三氯乙烯对生物体蛋白质组表达的影响，从蛋白质整体水平上探讨T c E 毒作用机理，可找出T C E 中毒的特异性生物效应指标，及时发现和防治T C E 中毒，从而降低T c E 的职业危害。毒物兴奋效应( h o n I l e s i s ) 是一种确实存在的生物学现象，表现为在最初的抑制性反应之后，对动态平衡破坏后的一种适度补偿。毒物兴奋效应是对低剂量条件下的剂量一反应关系的一种更科学、更精确的描述，低刹量条件下
5、的毒性反应并不遵循线性规律”。现实生活中机体接触环境化学污染物( E C P s ) 的方式多是长时间、低水平的接触，这种接触方式可能产生与高剂量接触截然不同的生物效应。所以开展低剂量环境污染物效应及其作用机制研究，有助于全面深入了解毒物与机体之间的相互作用，为进行危险度评价及卫生标准的制定提供参考。本课题运用蛋白质组学核心技术一一双向电泳( 2 D E ) 分析三氯乙烯染毒前、后L 0 2 肝细胞蛋白质组表达改变，应用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱( M A L D I T O F T O F M s ) 对差异蛋白斑点进行鉴定。初步探讨三氯乙烯中毒的关键蛋白和标志蛋白，为阐明T C
6、E 毒作用的分子机制提供新的线索，为找出T C E 中毒的特异性生物效应指标，及早发现和防治T c E 中毒奠定基础。同时分析低剂量T C E 作用L 0 2 肝细胞的效应，对低剂量T C E 的兴奋性效应做进一步探讨，为全面深入的了解T C E 与机体之间的相互作用，建立正确的T C E 危险度评价体系提供参考。方法：一、T C E 作用L _ 0 2 肝细胞剂量- 反应关系的确定培养L 0 2 肝细胞，使用O 、1 、5 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0p M T C E 分别刺激6 h 、1 2 h 、2 4 h ，M T T 法观察细胞的增殖功能，建立T C E 作用L
7、 0 2 肝细胞剂量反应关系。二、L J B 2 肝细胞总蛋自双向电泳条件的建立采用分子质量标准进行S D S 。P A G E 电泳，通过比较两种常用且质谱兼容的银染法一一E M B L 、B L U M 的灵敏度和分辨率，确定染色条件；细胞裂解液( 7 M中山人学硕十学位论文三氯乙烯致L 0 2 肝细胞蛋白质组差异表达的研究尿素，2 M 硫脲，4 c H A P S ，1 0 删T r i s ) 提取未经任何处理的L 0 2 肝细胞的总蛋白，使用线性梯度p H 3 1 1 范围的干胶条进行等电聚焦，初步估计L 0 2 肝细胞总蛋白等电点的大致范围；采用四种不同方法处理L 0 2 肝细胞总
8、蛋白：丙酮沉淀；超声裂解+ 丙酮沉淀：三氯乙酸沉淀；超声裂解+ 三氯乙酸沉淀。采用相同的双向电泳条件，观察比较双向电泳图谱等电聚焦效果，优化样本处理条件。三、T C E 诱导L 吆肝细胞毒的蛋白质差异表达研究以0 0 、3 O 、1 0 0 、4 0 0um o l lT c E 分别作用L 0 2 肝细胞2 4 h 后，提取细胞总蛋白，定量后再进行双向电泳，并平行重复3 次。染色凝胶成像后，运用I m a g e M a s t e r2 D5 O 软件进行图像分析，具体过程包括：蛋白质点的检测、量化、背景扣除、归一及匹配( m a t c h ) ，取不同批次凝胶上重复出现的差异表达蛋白点
9、进行肽质量指纹图谱及M A L D I T O F 一1 1 0 F M s 串联质谱，所得的图谱使用A B I公司的G P s 软件检索，以M A s C O T 为收索引擎，I P I h u m a n 数据库搜索。四、T C E 兴奋效应及其蛋白质组研究参照确定的T c E 剂量一反应关系，选取无明显作用的剂量( 1 “m 0 1 1 ) 作为兴奋效应初次刺激剂量，作用细胞1 2 h 后，再使用5 O 、1 0 0 、1 5 0 、2 0 O 、2 5 0 、3 0 0um o l l6 个不同剂量的T C E 分别刺激细胞，采用M T T 法比较增殖效应，确立兴奋效应研究的T C E
10、 剂量，进行相关细胞总蛋白的收集及丙酮沉淀处理，双向电泳分析比较差异蛋白，并对其作质谱分析鉴定。结果：一、T C E 作用L 0 2 肝细胞剂量一反应关系的确定随着T C E 剂量的增加，【广0 2 肝细胞增殖抑制功能增加。作用时间为6 h 和1 2 h 时，T C E 剂量达到5 0pm o l 1 增殖抑制具有显著性：增加作用时间至2 4 h后，具有显著性改变的剂量降低至3 0 um o l l ( P TP 8 I s 及多位点突变 2 4 】。推测T c E 可能通过损害v H L 基因诱导肾癌的发生。T c E 还可具有使c j u n 、c m y c 原癌基因启动子区域的甲基化水
11、平降低增加这两种基因m R N A 转录的作用，这些也与其致癌作用相关I l 】o4 、T c E 面临的问题国际癌症研究署( I A R c ) 口5 1 在1 9 9 5 年对T C E 致癌性分类做了修改，将其以前对人类非致癌性改为对人类可能致癌。国家为保护接触者身体健康，有效地防治三氯乙烯中毒，制定了职业性急性三氯乙烯中毒诊断标准。近年来，T c E 职业中毒时有发生，国内外因职业接触T c E 而引起中毒的报道很多，如不及时采取适当措施，势必危害更多工人的健康，对社会和经济造成重大损失。然而，针对三氯乙烯中毒尚无特效解毒剂，治疗主要以对症及支持疗法为主，使得针对性开展对T c E 中
12、毒高危人群早期诊断及中毒机理的研究已经成为迫切的医疗任务。目前，1 E 的生物检测指标仅限于接触指标，有必要寻找一个或一组特异性或相对特异的生物效应指标。上述国内外T c E 的毒作用机制研究仍停留在基园水平，而仅仅从基因的角度进行研究尚不能解决基因的表达时间、表达量、蛋白质翻译后加工和修饰等问题。几乎所一6 5 中山大学硕士学位论文三氯乙烯致L - 0 2 肝细胞蛋白质组差异表达的研究有的生理病理过程，以及药物和环境因子作用都依赖于蛋白质，并引起蛋白质组变化。任何一种疾病在其表现出任何可察觉的病症之前，肯定已经有某些蛋白质发生了变化，因此，寻找各种疾病的关键蛋白和标志蛋白，对于疾病的诊断、病
13、理研究和药物的筛选具有重要的意义。利用找到的早期标志蛋白，将可实现更加及时、准确的诊断，从而可是大限度的减少病人的痛苦，降低费用，挽救生命，甚至在早期就抑制疾病的形成口6 】；而且随着后基因组时代的到来，蛋白质组学研究已有很好的技术平台。从蛋白水平上研究T c E 的中毒机理，具有非常重要的实际和理论意义并且已经成为可能。参考文献： 1 】胡明霞，二氯乙烯的毒理学研究新进展 J 】国外医学卫生学分册，2 0 0 l ，2 8 ( 3 ) ：1 5 5 - 8 【2 】张坤海三氯乙烯对人体健康的影响【J 】职业与健康，2 0 0 3 ，1 9 ( 3 ) ：5 - 6【3 1G f i m nJ
14、 M ，B l o s s o ms J ，J a c k s o ns K ，e ta 1 n i c h l o r o e t h y l e n ea c c e I e f a t e sa na u t o i m m u n er e s p o n s eb yT h lTc e l la c t i v a t i o ni nM R L 州+ m i c e 【J 】I m m u n o p h a n n a c o I o g y ，2 0 0 0 ，4 6r 2 1 ：1 2 3 3 7 。 4 张锦周三氯乙烯急性染毒对大鼠肝脂质过氧化的影响 J 】中国公共卫生，2
15、 0 0 0 ，1 6( 4 ) ：3 0 8 9 【5 宋汉林，程崇泉，宿萍二氯乙烯对人体慢性影响的探讨 J 】职业卫生与病伤，19 9 5 ，1 0 ( 3 ) ：1 3 8 1 4 1 【6 】刘移民，艾玲保，肖勇梅等三氯乙烯对接触工人神经行为功能影响的初步研究【J 】中国职业医学，2 0 0 1 ，2 8 ( 4 ) ：1 2 1 4 7 】黄锦生，陈惠珍洗衣场所低浓度T c E 污染对人体免疫水平的影响 J 】中国公共卫生2 0 0 1 ，1 7 ( 8 ) ：7 l S 6 8 】李来玉，冷曙光，郑玉新，等三：氯乙烯药疹样皮炎代谢酶基因多态性的病例对照研究 J 】中国职业医学，2
16、0 0 2 ，2 9 ( 3 ) ：4 8 9 1 张雅洁，张桂梅，季卉等三氯乙烯致重症劲疹样皮炎伴多系统损害2 0 例【j 1 中华皮肤科杂志，2 0 0 l ，3 4 ( 5 ) ：3 9 3 ，3 ，【1 0 】J ；n g s o n go u ，z h 酌u no u ，D G a i lM c c 8 r v e e t8 i IT r i c h l o r o e t h y l e 船D 咕c r e a s e sH e a ts h o c kP m t e i n 9 0I n t e r a c t i o n sw i t hE n d o t h e l a lN i t r i cO x i d eS y n t h a s e ：I m p l i c a t i o n sf o rE n d o t h e l ja 1c e l lP r o J i
