《补料发酵工艺的应用及其研究进展》由会员分享，可在线阅读，更多相关《补料发酵工艺的应用及其研究进展（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 第35卷 第1期2005年3月工 业 微 生 物 Industrial MicrobiologyVol. 35 No. 1 Mar. 2005作者简介:蔡谨(1960年12月出生) ,男,博士,副教授。Caij 补料发酵工艺的应用及其研究进展蔡 谨, 孙章辉, 王 隽, 岑沛霖(浙江大学材料与化学工程学院生物工程研究所,杭州310027)摘 要 综述了补料工艺在发酵工业中应用和研究。介绍了补料发酵工艺及其优点,着重讨论了补料发酵动力学和控制理论研究,以期为补料发酵的应用提供充分的参考依据。关键词:补料发酵;动力学;控制早在1915年就有人在酵母大规模发酵过程中添加营养物,成功地增加了酵母产量
2、。随后,在一些由碳水化合物生产简单有机化合物(如甘油、 丙酮、丁醇和乳酸等)发酵生产中,相继出现了中间补加单一组分或多组分营养物的试验。结果是大多数发酵的产量都有所提高,培养基中各个成份得到有效利用。二战以后,补料工艺被广泛应用于抗生素、 氨基酸和维生素等产品的发酵生产1。但补料工艺几乎都是经验性的,对它的理论研究相对滞后。随着计算机的发展,人们不断尝试着把计算机技术应用于补料发酵的控制。但由于有关数学理论和模型相对落后,限制了计算机技术在这领域中的应用。二十世纪70年代末,一些科学家开始把微积分学、 矩阵、 泛函等数学理论应用到补料发酵的计算机控制。近年来,一些新兴的控制理论,尤其是模糊控制
3、理论和神经网络控制理论开始在补料发酵的控制上得到了运用。这些成果促进了补料工艺在发酵工业中更广泛的应用2 ,3 ,4。目前,补料工艺已是工业发酵领域中研究最多、应用最广的技术之一。本文结合一些例子,就补料工艺特点、 补料原则、 补料动力学和补料控制理论等问题展开讨论。1 补料发酵工艺概述补料发酵(Fed2batch Fermentation)就是指在分批发酵过程中,间歇或连续地补加含有限制性营养成分的新鲜培养基。早期的补料方式完全是凭经验进行的,即发酵到一定时间,经验性地添加一定量营养物。补料成分简单、 补加的数量少,这种补料方式简单易行,但往往无法有效控制发酵。在现代大规模发酵工业中,补料方
4、式已从简单一级补料发展到多级重复补料,从简单地补加一种营养物发展到补加几种营养物。补料发酵类型也更加多样。发酵类型按补料方式分,有连续补料、 不连续补料和多周期补料;按补加物料的组分分,可分为完全补料(补入完全的培养基)和半分批补料(补入一种或几种营养成分) ;按补料控制方式分,有反馈控制补料和无反馈控制补料;反馈控制补料还可分为直接控制补料和间接控制补料;按反应器数目分,有单级和多级之分;按反应器中发酵液体积变化分,有变体积补料和恒体积补料。补料一般是在发酵进行至大量生成产物的阶段,因合成产物和维持细胞活动的需要,有选择地补充营养物质。合适的补料工艺能够有效地控制微生物的中间代谢,使之向着有
5、利于产物积累的方向发展。补料发酵补加的营养物质大致有五类: 补充菌体所需的能源和碳源,如葡萄糖和液化淀粉等;补充菌体所需氮源,如蛋白胨、 豆饼粉、 玉米浆、 酵母粉和尿素等有机氮源,有些发酵还采取通入氨气或添加氨水等; 加入某些菌体生长代谢所需的微量元素和无机盐,如磷酸盐、 硫酸盐等; 对于产诱导酶的微生物,常在补料中适当加入该酶的作用底物,以提高酶的产量; 对一些抗生素发酵,往往需要补充抗生素形成的前体。表1是补料发酵中添加营养物的代表性例子:24 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.表
6、1 补料发酵中添加的各种营养物产品补料产品补料蛋白酶葡萄糖和蛋白胨灰黄霉素葡萄糖 单细胞蛋白甲醇新生霉素各种碳源和氮源 2淀粉酶淀粉假丝菌素葡萄糖 2葡萄糖酶淀粉赤霉素葡萄糖 青霉素酰胺酶 苯乙酸钠利福霉素脂肪酸、 葡萄糖 纤维素酶葡萄糖核黄素蜜糖、 葡萄糖 谷氨酸氨水、 尿素、 乙醇维生素B12葡萄糖 苯丙氨酸葡萄糖乙醇葡萄糖 赖氨酸乙醇、 尿素乙二醇甲苯 酪氨酸苯酚丙酮和丁醇麦芽汁 色氨酸甘油、 乙醇、 葡萄糖 聚232羟基丁醇葡萄糖 柠檬酸铵盐木糖醇碳源 乳酸葡萄糖甘油可发酵的糖、 碳酸钙 葡萄糖酸碳酸钙、 氢氧化钙酵母麦芽汁、 氮源 青霉素苯乙酸、 葡萄糖大肠杆菌葡萄糖 链霉素葡萄糖、
7、 硫酸铵苏云金杆菌葡萄糖 土霉素花生油、 豆油生长激素酵母抽提物 金霉素葡萄糖 2胡萝卜素葡萄糖 头孢菌素C葡萄糖、 蛋氨酸肌苷糖液 四环素葡萄糖红曲色素葡萄糖 维生素B2发酵糖亚麻酸糖液干扰素葡萄糖溶葡球菌酶葡萄糖、 无机盐 洁霉素葡萄糖人参皂苷和多糖 糖液 表皮生长因子 葡萄糖22酮基2L2古龙酸 山梨糖补料工艺之所以成为发酵工业的应用和研究的热点,主要因为它有如下特点:(1)有利于菌体的高密度培养 高密度发酵的生物量可达60150g/ L ,需投入25倍于生物量的营养物。所以,若将所有的补料一次加到培养基中,过高浓度的营养物势必造成菌体代谢的紊乱,表现为迟滞期延长,比生长速率降低,得率下
8、降。每种营养物都会有一个极限值,如铵盐5 g/ L ,磷酸盐10g/L ,葡萄糖100 g/ L。要使微生物始终处于适宜生长的环境条件和达到高菌体浓度,必须采用恰当的补料方式。(2)降低培养基中有毒底物对菌体生长的抑制有些发酵需要利用甲醇、 醋酸和苯酚等有毒物质作为培养基成分,这些物质即使在较低浓度下,也会对微生物生长产生抑制作用。而通过补料,可减小抑制作用。例如,苯乙酸钠是青霉素G生物合成的前体,但它对产黄青霉有毒性且易被菌体氧化。生产上可采取少量多次或连续地补加低浓度的苯乙酸钠,使它在培养基中的浓度维持在0. 08 %0. 1 % ,保证菌体正常生长和青霉素发酵。(3)解除高浓度营养物和分
9、解代谢物引起的阻遏作用 葡萄糖分解代谢物可阻遏包括纤维素酶、 蛋白酶、 淀粉酶、 转化酶以及氨基酸合成酶等酶的合成。通过补料来控制菌体生长速率以使酶的合成明显去阻遏;通过补料还可以减小分解代谢产生的乙醇、 甲酸、 乳酸等副产物对菌体生长的不利影响。(4)维持有利的发酵条件 发酵过程中常常发生pH值的变化,直接加酸或加碱可以快速调整酸碱度,而通过补加碳源或氮源,可以缓慢而根本地调整pH值;对于好氧发酵,一次性投糖过多会造成细胞生长过快,快速消耗氧气,而常规的通风搅拌无法满足供氧需求。补料可以缓解该矛盾;此外,补料还可调整发酵液粘度、 氧传递系数等物性参数,改善发酵环境,有利于细胞生长和产物合成。
10、2 补料发酵的动力学特征及模型微生物发酵是多种物质参与的复杂代谢反应的综合结果,完全从机理出发直接建立过程模型较难实现,所以,发酵动力学方程几乎都是通过数学模拟得到的。数学模拟的难点在于发酵过程复杂性、 非线性以及对象本身具有菌株变异、 培养基组成和其他环境因素微妙差异等许多不确定因素。迄今为止,补料发酵已有许多数学模型,有些是经验模型,有些是机理模型,更多是把两者结合起来。比较早提出补料发酵数学模型的是Yoshida等人5,他们的模型比较简单。该模型是以物料平衡为基础,并假定补料前后反应液体积不变。后来,Pirt研究了恒体积(补料操作体系)的特征。当菌体生长开始受营养物限制时,细胞浓度(x)
11、呈线性增加,比生长速率()随之线性下降。实际上,补料前后发酵液体积发生变化在生产中更为常见。为此,Pirt提出拟稳态理论。该理论是假定补料发酵所补的限制性营养物仅被用来合成细胞物质,遵循Mon2od动力学方程,在dx dt0 ,ds dt0的情况下,= D ,这个状态就称拟稳态。上述D为稀释率,s为限制性营养物浓度,t为时间。拟稳态下,和D因培养液体积不断增加而以相同的速率下降。Pirt进一步研究了限制性营养物同时作为能源时的情况,理论推导发现,在限制补料速率的情况下,细胞的生长是34第1期蔡 谨,等:补料发酵工艺的应用及其研究进展第35卷 1995-2005 Tsinghua Tongfan
12、g Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.有限的,可用公式表示为:xm=FS m,式中xm为最大细胞浓度,F为补料速率,m为维持能系数。此模型相对较为完善,被大多数工作者沿用或加以改良。Keller和Dunn把变体积补料分批培养的数学模型分三种情况,即=m,=常数或s0。在=m的情况下,需在低补加速率、 低体积变化及补加高浓度营养物条件下操作,才能获得最大生物量。在=常数时,需采用指数补加并维持营养物浓度为常数。在s0时,细胞浓度与生长动力学没有关系。一些研究同时考虑变体积和恒体积补料。Dunn以Monod动力学方程和质量平衡原理为基础,建立了变
13、体积连续补料分批培养和恒体积补料分批培养的数学模型,在模型中采用无因次变量。推导发现,在保持低流加速率和低限制性营养物浓度时,变体积连续补料分批培养和恒体积补料分批培养得到的无因次产量相当。Yamane也采用类似方法,建立了变体积和恒体积补料分批培养的数学模型。利用计算机进行模拟,研究两种情况下初始条件和包括操作条件、 维持能系数和饱和常数在内的控制参数对细胞生长的影响。结果表明在恒体积和变体积两种情况下,生长都从对数期快速转到稳定期。在对数期末,无因次营养物浓度很低,稳定期无因次比生长速率、 营养物浓度及两者的变化率都很小。在恒体积时,无因次细胞浓度的变化率还取决于稀释率和初始条件。上述这些
14、模型绝大多数是以Monod动力学方程为基础。这主要是由于在大多数情况下,实验数据与Monod方程较为接近。而Bajpai和Reuss6利用Contois动力学和底物抑制动力学,建立了一系列青霉素发酵的数学模型,其中包括补料情况下菌丝量、 青霉素产量、 营养物及体积的变化模型。模型很好地描述了实验所观察到的比生长速率、 葡萄糖消耗速率以及青霉素生成速率,并通过拟合实验数据,得到了模型参数值。通过这些过程模拟得到的数学模型,可以分析过程的内在机理,预测补料发酵的生化过程,还可以在模型基础上进行过程优化与控制,提高发酵产量和质量,降低能耗与成本。3 补料发酵的控制补料发酵有两个基本问题。一个是补什么
15、。补加的物质应该是能产生最大效应的营养物。这需要对发酵微生物生理和生化有充分的了解。另一个是如何控制补料。补料过量或不足都会影响菌体生长和产物的形成,甚至会导致发酵失败。3. 1 无反馈控制的补料这种控制方式所加入营养物的流量是预先设定的。因此,反映系统状态的数学模型的准确程度是成败的关键。目前无反馈控制补料方式有三种:恒速补料、 变速补料和指数补料。3. 1. 1 恒速补料在恒速补料发酵中,以预先设定的恒定速率补加限制性营养物。相对菌体来说,营养物浓度是逐渐降低的,菌体比生长速率也是下降的,而菌体总量是线性增加的。恒速补料在一定程度上满足了菌体对养料的需要,避免了营养物抑制,但这种方法往往只
16、是根据一个参数指标控制的。这类操作常见于早期报道。3. 1. 2 变速补料变速补料是在培养过程中补加速率以梯度、 阶段或线性等方式不断增加。它可以在菌体浓度较高的情况下加入更多营养物来促进细胞的生长,实现细胞比生长速率不断增加,有利于产物的形成。尽管比较粗糙,但要优于恒速补加法7。3. 1. 3 指数补料指数补料是一种简单而行之有效的方法。补加速率呈指数增加,它能够使反应器中营养物浓度控制在较低的水平,而使菌体的比生长速率为恒定值,菌体密度呈指数增加。指数补料较好地配合菌体的生长过程,又不需要特别复杂的仪器,因而,受到了较多的重视。Yee8认为大肠杆菌高密度培养中最成功的手段就是指数补料。当然,这种方法需要对发酵的具体过程有充分的了解,以确定合适的补料参数。3. 2 反馈控制补料实际发酵过程常会与预设过程有偏差,如果能及时地纠正偏差,就可使反应朝预定方向进行,否则将很难达到预期的目标。反馈控制补料就是在发酵
