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1、热点聚焦 Hotspot在线净化 LC-MS/MS 系统对动物组织中克伦特罗残留的检测分析赵孔祥1 王海鉴21. 天津出入境检验检疫局食检中心 ； 2. 赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司克伦特罗俗称瘦肉精，常被用作饲料添加剂以提高家畜的瘦肉含量，但由于其严重的毒副作用，欧盟于 1988年 1 月 1 日起禁止盐酸克伦特罗物质当饲料添加剂使用。1991 年被 FDA 禁止。1997 年，中华人民共和国农业部下文严禁 - 肾上腺素类激素在饲料和畜牧生产中使用，盐酸克伦特罗列为第一位。2009 年 7 月为应对日、韩从我国食品中检出盐酸克伦特罗事件，质检系统确定了了更严格的出口判定标准 (0.
2、05g/kg)， 食品检测已经进入超痕量时代。在此背景下，我们需要更有效的前处理手段以便我们得到更加浓缩更加纯净的样品来提高我们的信号降低我们的噪音。基于色谱原理的创新样品制备方法Turbo Flow 技术为我们提供了新的思路。这种在线自动过程处理技术结合了扩散、化学和体积排除的原理，在捕获感兴趣分析物的同时，快速消除基质干扰。本实验旨在建立一个前处理简单，选择性灵敏度高的克伦特罗的 Turbo Flow 实用在线净化方法，并确定该方法的检出限。1 实验部分 1.1 样品制备取 5g 动物组织样品与 10mL 乙腈，10% 乙酸铵 (1:3)混合溶液混匀匀浆 10 分钟，5000r/min 离
3、心十分钟取1mL 上清液经过 0.22m 注射过膜，上机。1.2 Turbo Flow 条件系统：Thermo Scientific Aria TLX-1 controlled by Aria software在线净化柱： Turbo Flow Cyclone MCX 0.550mm进样体积：50L上样溶剂：0.1% 的甲酸水溶剂上样流速：2mL/min洗脱溶剂：1%的氨水甲醇溶液洗脱体积：50L1.3 HPLC 方法条件色谱柱 ： Hypersil GOLD aQ 3m 100 X 2.1mm流路 A ： 0.1% 的甲酸水溶液流路 B ： 甲醇时间(min)A%B%流速mL/min0901
4、00.4190100.42.3380200.42.8360400.4610900.46.510900.4890100.41.4 质谱条件1.4.1 调谐参数系统 TSQUltra AM离子源极性：正离子模式喷雾电压：4500V鞘气压(N2)：50arb辅助气压(N2)：16arb毛细管柱温度：350C碰撞气体(Ar)：1.5mTorrSkimmer offset10VQ1/Q3峰分辨度：0.7u (单位质量)1.4.2 SRM 反应参数被分析组分母离子 (m/z)子离子 (m/z)碰撞能量 (V)管透镜电压 (V)克伦特罗-D9286169.128104克伦特罗277132.22994168.
5、1*2894203.61594* 为定量离子2 结果与讨论 食物样品本身基质比较复杂，在进行检测之前往往需要一个较长的样品预处理过程。比如贾晓飞等使用酶解，高氯酸沉淀蛋白，邵兵等应用 HLB 和 MCX 两次 SPE对食品中 2- 受体激动剂进行残留检测都取得了很好的效果，这些方法的目的也都是为了获得更加浓缩和纯净的样品。应用 Turbo-Flow 在线净化技术使得这些工作变得更加图 1 Turbo Flow 在线净化与 HPLC 联用方法参数热点聚焦 Hotspot简洁方便，减少了中间步骤和偶然误差，使得加标回收的重复性很稳定，0.05g/kg 浓度下六平行 RSD 为 5.36% ；同时由
6、于样品更加纯净浓缩，干扰较少，此方法在添加量为 0.02g/kg 浓度下峰型良好 ( 如图 2 所示 )。根据欧盟法规计算此方法检出限 (LOD) 为 0.002g/kg，定量限为0.006g/kg 已经能轻松应对实际需要。同时如果有实际需要，可以采用更长的净化柱 (100mm 规格 ) 或者采用串联净化柱的方法进一步增加样品浓缩倍数， 来提高检出限。由于采用了在线净化系统，进入分析色谱柱的样品也更图 2 0.02g/kg 浓度色谱图图 3 20pg/g 添加回收比较图。左图为 MCX 固相萃取净化，右图为在线净化结果为纯净， 一定程度上降低了噪音和杂峰的产生。如图 3 所示，采用 Turbo
7、 Flow 技术一定程度上起到了稳定基线的作用。运用 Transcend 在线净化系统的操作软件 Aria OS 的变量设置功能，可以方便设置批处理程序尝试不同的洗脱溶液。在比较不同浓度的氨水甲醇溶液后，结果表明1% 的氨水甲醇溶液作为洗脱溶液的效果最优。使用外标法计算其与不经过净化柱的结果得到其绝对回收率为79%84%。而且此浓度的氨水甲醇溶液以 0.2mL/min 的速度与 0.4mL/min 的分析柱溶液混合不会对高效液相色谱产生不良影响，在使用此方法千针后，10 个平行的保留时间 RSD 仍然只有 0.1%。分别配置 5pg/mL，10pg/mL，20pg/mL，50pg/mL，100
8、pg/mL，200pg/mL，500pg/mL，1ng/mL，2ng/mL的克伦特罗标准溶液，其中都混有 100pg/mL 内标，内标法定量得到标准曲线有很好的线性 ( 曲线见图 3)，相关系数 R2 为 0.9995向 5g 动物组织中分别添加 100pg、250pg、500pg克伦特罗标准，内标法定量，计算其回收率结果表明，经过在线净化和内标法校正后样品回收率非常稳定。简单的前处理步骤带来最少的偶然误差。表 1 克伦特罗不同添加水平回收率添加水平平均回收率%RSD%*20pg/g94.25.5850pg/g96.55.36100pg/g94.42.49* 为六平行水平下 RSD 值3 结论
9、 采用 Turbo Flow 在线净化技术可以非常方便的按要求得到更加浓缩，干扰更少的样品，提高了信噪比，降低了检出限。Turbo Flow 在线净化技术简化了前处理步骤，减少了图 4 克伦特罗标准曲线热点聚焦 Hotspot偶然误差获得了令人满意的重现性。使用 Aria OS 操作系统，我们可以很方便的设置批处理变量，尝试不同种类或者比例的上样或者洗脱溶剂。4 参考文献 1 Lee D W, Mona I C, Daniel R D. J Chromatogr B. 2004, 813: 35-452 Jose B, Patricia M, Miguel M, et al. Anal Chi
10、m Acta. 2005, 529 : 199-2053 Doerge D R,Churchwell M I,Holder C L,et al.Anal Chem,1996,68(11):19184 Joseph HWL and Cheang SK. J AOAC Int. 2004, 87 : 31-38 3 贾晓飞，蔡增轩，潘红锋5 任一平 . 超高效液相色谱 - 电喷雾串联四极杆质谱法检测动物组织中的 20 种 2- 受体激动剂的残留 . 卫生研究 2007，046 吴国华，邵兵，孟娟 . 气相色谱 - 质谱测定尿液中的克伦特罗 . 中国公共卫生 ,2004, 20 (2): 235236
