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1、军医进修学院硕士学位论文英文缩略词表军医进修学院研究生学位论文原创性声明秉承我院“敬业、勤奋、求实、创新”的学风，本人声明：所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得我院或其他教育机构的学位及证书而使用过的材科，对本文的研究作出贡献的个人或集体，均已在文中做了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：指导教师签名：日期：j 一7 一岁习日期：e P 7 一弘J军医进修学院研究生学位论文版权使用授权书本人保证毕业
2、离院后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为军医进修学院或解放军总医院。学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文原件、复印件和电子版本，可以采用影印、缩印、扫描或其它手段保存论文以供被查阅和借阅。学院可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) 。论文作者签名名，乒指导教师签名：日期：a 一7 一，7日期：7 7 一歹一，f军医进修学院硕七学位论文环孢素A 对犬心房颤动的影晌中文摘要背景及目的心房颤动诱导的心房电重构在房颤的发病机制中有重要作用，重构的机制在于房颤引起的心房电生理及潜在的离子通道的改变，此过程中钙调神经磷酸酶信号通路激活发挥重要作用本研究利用钙调神经磷酸酶信号通路的抑
3、制剂环孢素A 对快速起搏房颤模型犬进行干预，以评价环孢素A 对房颤犬心房电生理及离子通道蛋白表迭的影响方法健康雄牲杂种犬1 8 只，体重1 7 0 2 3 2 ( 1 9 0 5 2 0 3 ) k g ，年龄在2 O 4 0 岁之间，平均年龄3 0 0 6 9 岁采用随机数字法分为三组：A F 组、S h a m组( 假手术对照组) 、C s A 组( 环孢素A 干预组) ，各组基线资料一致1 快速起搏心房建立犬房颤模型，采用经皮血管穿刺的方法，经穿刺血管放置电极，记录标测并对比各组起搏前后P 波时程心房有效不应期( A E R P ) 、A E R P 频率适应性，心房内传导速度( c v
4、 ) ，激动波长( 札) 等指标分析C s A 组与A F 组间的差异2 起搏8 周后开胸取心房组织，免疫印迹法( W e s t e r nB l o t ) 检测各组离子通道蛋白表达的变化，结果1 电生理特性A F 组C s A 组较S h a m 组P 波时程延长( P o 0 5 ) 。起搏8 周后A F 、C s A 两组P波时限与s I 啪组及术前自身相比均明显延长( P l o 用异丁醇，也可用去离子水1 。聚合完成( 约1 5 m i n ) 后，倒掉覆盖液体，用去离子水洗凝胶上部数次，尽可能吸干凝胶顶端的残存液体。军医进修学院硕士学位论文配制浓缩胶，每块胶用量为2 m l ，
5、混匀后注入玻璃板缝隙，插入梳子，避免混入气泡，垂直放置于室温下，1 5 m i n 。在浓缩胶聚合的同时，将样品与加样缓冲液混匀，l O O X 3X3 m i n 。在浓缩胶聚合后( 约l S m i n ) ，用去离子水冲洗梳孔，将凝胶放入电泳槽中。上下槽均加入电泳缓冲液，检查是否泄漏。驱除玻璃板问凝胶底部的气泡。上样前用上槽缓冲液冲洗梳孔。按次序上样，注意加蛋白质分子量标准。最好将加样缓冲液加入未使用的梳孔中。电泳：开始时电压8 V c m 凝胶( I O O V ) ，染料进入分离胶后，增加到1 5 V c 舶n 凝胶( 2 0 0 V ) ，电泳到染料抵达分离胶底部，断电( 约需3
6、8 - 3 9 m i n ) 。2 ) 取下凝胶，进行转膜：戴手套，剪2 张滤纸和l 张P V D F 膜，大小与凝胶完全吻合，不能大于凝胶 去离子水5 l n i n 电转液 l O m i n ：将滤纸浸入电转液 1 0 m i n ；安装转膜装置：从吖红色) 专 1 0m i n 。流水冲洗，干燥保存。1 4 4 蛋白印迹结果分析：采用L a b W o r k si m a g eA c q u i s i t i o na n dA n a l y s i sS o f t w a r e 进行分析，以目的条带的相对光密度值( I O D ) 代表目的蛋白表达量。1 4 5 统计学
7、分析实验数据采用S P S S l 3 0 软件分析，以均数标准差表示，计量资料采用t 检验或方差分析，计数资料采用卡方检验，检验水准P 0 0 5 为差异有显著性。2 结果2 I A F 组、C s A 组、S h a m 组之间心房L 型钙通道d1 C ( L 。1 c ) 亚单位表达情况比较：A F 组较S h a m 组明显降低( P O 0 1 ) ；A F 组较C s A 组明显降低( P O 0 1 ) ，S h a m 组与C s A 组相比差异不显著( P - - 0 2 0 9 ) 见下面图表：兰组钙通道蛋白L Ql c 表达I O D 值( 均致标准差)军医进修学院硕士学
8、位论文A FO AS h a m各组犬心房组织L al c 的表达，W e s t e r n b l o t 图象，上图为L al c 蛋白电泳条带，下图为G A D P H 加样内参照2 2 A F 组、C s A 组、S h a m 组之间心房钾通道蛋白K v l 5 表达情况比较：A F 组较S h a m 组明显降低( P O 0 1 ) ，A F 组较C s A 组明显降低( P O 0 1 ) ，S h a m 组与C s A 组相比差异不显著( P = o 1 6 5 ) 。见下面图表：三组钾通道蛋白K v i 5 表达1 0 D 值( 均数标准差)军医进修学院硕士学位论文A
9、FC s AS h a m各组犬心房组织K v I 5 的表达，W e s t e r n b l o t 图象，上图为K v l 5 蛋白电泳条带，下图为G A D P H 加样内参照。2 3 A F 组、C & A 组、S h a m 组之间心房钾通道蛋白K v 4 3 表达情况比较：A F 组较S h a m 组明显降低( P 0 0 1 ) 舢组较C s A 组明显降低( P 0 0 1 ) ，S h a m 组与C s A 组相比差异不显著( P ：o 0 9 6 ) 。见下面图表：三组钾通道蛋白K v 4 3 表达l o D 值( 均致标准差)各组犬心房组织K v 4 3 的表达，
10、W e u e r a b l o t 图象，上图为K v 4 3 蛋白电泳条带，下图为G A D P H 加样内参照3 讨论随着对A F 发生机制研究的逐步深入发现A F 是一种自我延续性心律2 6军医进修学院硕士学位论文失常，A F 可以导致A F , 其机制是A F 引起了心房电重构( a t r i a le l e c t r i c a lr e m o d e l i n g , A E R ) I n l 。A E R 是指A F 引起心房肌有效不应期( A E R P ) 缩短、A E R P 频率适应性降低和传导速度( c v ) 减慢等心房电生理学特性改变。这些电生理改变
11、通过缩短心房内折返环路的波长O V L = A E R P c v ) 使心房内允许存在的折返环数量增加从而促进A F 的复发和维持。心房整体的电生理改变原因在于细胞水平的动作电位时程( A P D ) 缩短及A P D 频率适应性降低。依靠膜片钳技术的应用, A F 弓I 起的细胞动作电位改变在离子通道水平上机制研究迅速取得进展。而这些对于A F 时心房离子通道改变的深人研究将会帮助研究者找到破解A F 之迷的道路。在起搏房速诱发的心房电重构得到人们认识后，关于电重构背后的离子机制的研究就展开了来自于实验动物及慢性A F 患者的细胞动作电位记录以及单个心房细胞膜片钳实验研究显示出一致的趋势。
12、在所有离子通道的改变中，在A F 发病中作用最为明显的当属L 型钙通道电流( 昆“)的明显减少。这一发现解释了A ID 缩短和A P D 频率适应性降低的主要原因所在瞄1 。除此之外，还在A F 患剖列及动物实验f 2 3 1 发现瞬时外向钾电流( k ) 、持续外向钾电流( 亿。) 的明显降低。离子通道电流的明显改变与起着决定作用的离子通道蛋白关系密切。本部分研究选择L 型钙离子通道及钾通道K v l 5 及K v 4 3 的蛋白表达作为研究对象，其特别之外在于选择免疫抑制剂环孢素A ( C s A ) 作为干预因素，探讨在C s A 作用下A F 犬离子通道蛋白表达的变化。3 1 钙通道钙
13、通道电流( I c o ) 是心肌细胞动作电位( A P ) 及其兴奋功能组成的重要部分。钙离子还可以形成钙信使系统。心房肌电压依赖型钙通道主要分为L 型和T 型，其中L 型对兴奋收缩耦联最为重要，钙通道阻滞剂主要作用于L 型钙通道。尼i 茁调节人类心房频率依赖性的A P D 和E R P 的变化中起重要作用，是参与心房电重构的主要离子通道1 4 0 1 。Y u e 等人f 2 3 1 在动物实验中发现，对实验犬予枷次，分的心房起搏，随着起搏时间的延长，可诱发的A F 的持续时问逐渐延长，心房E R P 逐渐缩短，七儿的电流密度进行性下降，但是不伴有通道动力学及电压依赖性的改军医进修学院硕士
14、学位论文变。T 型钙通道未见异常。钙电流是A P 复极相主要内向电流，其减弱必然使外向电流相对增加从而使心肌复极加快, A P D 和E R P 缩短。所以，昆吐的减弱可能是心房电重构的主要离子机制。Y u e 等人塘过实验观察证实了上述推测。他们发现：A F 和钙通道阻滞剂硝苯地平对A P 形态和时程的影响相似；在实验动物经过慢性起搏4 2 天后，钙电流的减弱已经发生，此时硝苯地平对A P 时程和形态的影响也随之消失：不起搏的对照犬在给予硝苯地平后A P 的变化与快速起搏实验犬相同：钙激动剂B a y K 8 6 4 4 可以逆转慢性起搏造成的A P 变化。Y u e 等人的研究证实持续的心
15、房快速起搏降低了昆旺，而降低后的进一步导致心房细胞A P D 的缩短和A P D 频率适应性的降低，这与临床上具有较高A F 易感性患者的情况类似 t 9 l ，同时发现此类患者也存在心房E R P 缩短及其频率适应性降低。再次表明细胞层醯的电生理改变就是心房不应期改变及A F 持续能力增强的原因所在。心房的扩大可使患者易发A F ，心房扩大患者的心房肌细胞尼。也降低，该类患者的A P D 及A P D 的频率适应性也都有降低【4 1 l ，这些临床患者的电生理变化与犬快速起搏模型的变化在性质上十分类似。然而，在一些其它心脏疾病的实验动物模型的离子通道研究中，出现了一些不一致的结果。在起搏器诱
16、导的犬心室衰竭模型的心室肌细胞，J & 或不变【4 2 1 或降低【矧。由此可见，虽然都是受到起搏器快速电刺激，心房细胞与心室细胞的乜所发生的改变却是不一致的。而A F 所诱发的L 钙通道改变中潜在的细胞内信号传导通路的研究尚未取得突破性的进展。七，上降低其它的可能临床意义。A F 复律后存在心房机械功能的延迟恢复，并伴有患者体力的延迟恢复 4 4 5 1 。两者可促进A F 复律后血栓栓塞事件的发生【拍明。这种现象称为“心房顿抑”。在药物及直流电复律后都会出现心房顿抑现象，而在没有A F 前提下的直流电复律没有心房顿抑发生 4 8 4 9 5 0 l 。由此可知，A F 本身还改变了心房细胞的收缩性能，而这种A F 诱导的心房收缩功能不全只在A F 转复为窦律后，使心房协调收缩得以恢复时才表现出来。L e i s t a d 等人【5 l 】研究显示短时的A F 即
