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1、http:/ - 1 - 利用 PCR-RFLP 技术鉴定部分沙梨（利用 PCR-RFLP 技术鉴定部分沙梨（Pyrus pyrifoliaPyrus pyrifolia Nakai）品种自交不亲和基因型（S 基因型） Nakai）品种自交不亲和基因型（S 基因型） 辜青青1，2，张青林1，胡红菊3，陈启亮3，罗正荣1 1华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉（430070） 2江西农业大学农学院，南昌（330045） 3湖北省农业科学院果树茶业研究所，武汉（430209） E-mail： 摘 要：摘 要： 自交不亲和基因型的鉴定， 对于沙梨授粉品种选择及育种亲本选配具重要意义。 本
2、试验利用 S 基因特异性 PCR-RFLP 技术并辅以人工授粉和 S 基因型信息，鉴定了我国 原产部分沙梨品种 S 基因型； 并分别在苍溪雪梨和灌阳雪梨中发现了 2 个新的自交不亲 和等位基因S38和S39。 关键词：关键词：沙梨，自交不亲和基因型，PCR-RFLP 梨为蔷薇科植物，绝大多数品种自花授粉不能结实，相同自交不亲和基因型（self-incompatibility genotype, S-genotype）品种间异花授粉也不能结实，具配子体型自交不亲和 （GSI） 性质1。 该性质由单个 S 位点上的复等位基因 （self-incompatibility allele, S-alle
3、le or S-gene）所控制，当花粉 S 基因与花柱两个 S 基因均不相同时才能正常受精。在蔷薇科植物中，花柱表达的与自交不亲和相关联的蛋白质为 S-RNase2。S-RNase 基因基本结构包含5 个保守区（C1, C2, C3, RC4 and C5）和 1 个位于 C2区和 C3区间的高变区（HV） ，其中高变区包含一个具有长度和序列多态性的内含子3。 自交不亲和性基因型的鉴定方法主要有：田间授粉试验4，花柱可溶性蛋白等电聚焦电泳及分子标记法5, 6，双向聚丙烯凝胶电泳法7，授粉花柱离体培养法8，S 基因特异性PCR 分析方法916等。S 基因特异性 PCR 分析是一种快速、简便的方
4、法，已在苹果9、扁桃10、李11、 甜樱桃12和梨1318等果树 S 基因型鉴定中广泛应用。迄今，国外已鉴定 10 个沙梨 S 基因， S1S7 1946 年由 Terami 等鉴定，S8于 2001 年鉴定14，S9 与 S10于2002 年鉴定19, 17；国内对沙梨 S 基因型鉴定仅见零星报道20。本试验利用 S 基因特异性PCR-RFLP 技术并结合授粉试验，鉴定了部分主栽沙梨品种 S 基因型，以期为授粉品种选择及育种亲本选配提供科学依据。 1. 材料和方法材料和方法 1. 1 材料 材料 供试沙梨（Pyrus pyrifolia Nakai）品种共 18 份（见表 1） ，全部采自湖
5、北省农业科学院果树茶业研究所国家果树种质沙梨圃。 采集的无病虫幼叶置冰浴条件下带回实验室， 液氮速冻后于-80保存待试。 1. 2 方法 方法 1. 2. 1 梨基因组总 梨基因组总 DNA 提取提取 采用Cheng 等22CTAB法。DNA质量及浓度用Cary-50紫外分光光度计检测并稀释至10ng/l备用。 http:/ - 2 - 表 1 供试沙梨品种 S 基因型及来源 Table 1 S-genotypes and source of 18 Japanese pears in the experiment 代号 Code 品种 Cultivar S 基因型 S-genotype 来源
6、Source亲本 Pedigree 1 今村秋 Imamuraaki S1S61) Japan Unknown 2 菊水 Kikusui S2S41) Japan TaihakuNijisseiki (S2S4) 2) 3 丰水 Housui S3S51) Japan Kosui (S4S5) 2)I-333) 4 晚三吉 Okusankichi S5S71) Japan Unknown 5 新兴 Shinkou S4S91) Japan Open pollination from Okusankichi 6 华梨 1 号 Huali 1 Unknown ChinaShounanEnoshim
7、a 7 湘南 Shounan Unknown Japan Chojuro (S2S3) 2)Imamuraaki (S1S6) 1) 8 西子绿 Xizil Unknown ChinaShinseiki (S3S4) 2)Yakumo (S1S4) 2)Hangqing 9 新杭 Xinhang Unknown ChinaShinseiki (S3S4) 2)Hangqing 10 清香 Qingxiang Unknown ChinaShinseiki (S3S4) 2)Sanhua 11 三花 Sanhua Unknown ChinaUnknown 12 黄蜜(今村夏) Huangmi (I
8、mamuranatsu) Unknown Japan Unknown 13 黄花 Huanghua Unknown ChinaHuangmiSanhua 14 二宫白 Ninomiyahaku Unknown Japan YaliShinchu 15 华梨 2 号 Huali 2 Unknown ChinaNinomiyahakuKikusui (S2S4) 1) 16 宝珠梨 Baozhuli Unknown ChinaUnknown 17 苍溪雪梨 Cangxixueli Unknown ChinaUnknown 18 灌阳雪梨 Guanyangxueli Unknown ChinaUnk
9、nown 1) Takasaki et al., 200418； 2)徐义流，张绍铃，20034；3)Sawamura et al., 200421 1. 2. 2 S 基因特异性基因特异性 PCR 扩增 扩增 参 考 Takasaki 等18方 法 。 所 用 引 物 共 3 条 ： 正 向 引 物 FTQQYQ（5TTTACGCAGCAATATCAG-3），来源于保守区1(C1)；反向引物 anti-IIWPNV5 - AC(A/G)TTCGGCCAAATAATT - 3和anti-TIWPNV（5 ACGTTTGGCCAAATAGTT - 3），来源于HV区下游保守区。引物序列由上海生工
10、生物工程技术服务有限公司合成。 1. 2. 3 S 基因特异性的限制性内切酶消化基因特异性的限制性内切酶消化 取 10l PCR 产物，加入 1.15l 10酶切缓冲液及 0.3l 10 U/l S 基因特异性的限制性内切酶，37消化 4h 后终止反应，用含 0.5g/mlEB 的 2%琼脂糖凝胶，在 2.5v/cm 电压下电泳 3h，SYNGENE 凝胶成像系统观察记录。用来消化 PCR 产物的 S 基因特异性限制性内切酶有 Sfc(S1,S8)、Afl(S2)、PpuM(S3,S5)、Nde(S4)、 AlwN(S5)、Hinc(S6)、Acc(S6, S7,S8)、Nru(S8)、Bst
11、B(S9)（MBI 公司） 。 1. 2. 4 田间授粉 田间授粉 在湖北省农业科学院果树茶业研究所沙梨资源圃进行。共授30个花序，每花序留2花，于气球期去雄和套袋。 授粉后7080天统计花朵坐果率及单果平均种子数。 以坐果率低于30%作为该组合授粉不亲和的指标23。 http:/ - 3 - 1. 2. 5 目的片段克隆、测序及序列分析 目的片段克隆、测序及序列分析 切下含目的 DNA 片段的琼脂块，UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒（美国 QIAGEN Operon 公司） 进行 DNA 片段回收， pMD18-T Vector 试剂盒 （TaKaRa 宝生物工程有限公司）对回收的
12、 DNA 片段进行连接反应，以大肠杆菌感受态细胞（DH5）为转化受体。取含增值后阳性克隆的菌液 5L 作 PCR 鉴定，将含目的片段的菌液送北京三博远志生物技术有限责任公司测序。利用 BLAST 对测序序列进行同源性搜索，并用 Clustal X（1.81）进行序列比对。 2. 结果与讨论结果与讨论 2. 1 S 基因型已知的日本原产沙梨品种基因型已知的日本原产沙梨品种 S 基因型的鉴定基因型的鉴定 为了验证PCR-RFLP技术的可靠性， 对5个S基因型已知的日本沙梨品种 今村秋 （S1S6） 、菊水（S2S4） 、丰水（S3S5） 、晚三吉（S5S7） 、新兴（S4S9） 进行了分析。结果表
13、明扩增片段大小与前人报道13, 18相符（图 1） 。 图 1 供试沙梨品种基因组 DNA S 基因特异性 PCR 扩增结果 S3与 S5 PCR 扩增片段大小相同 M. DNA Marker DL 2000 1. 今村秋(S1S6) 2. 菊水(S2S4) 3. 丰水(S3S5) 4. 晚三吉(S5S7) 5. 新兴(S4S9) 6. 华梨 1 号 7. 湘南 8. 西子绿 9. 新杭 10. 清香 11. 三花 12. 黄蜜（今村夏） 13. 黄花 14. 二宫白 15. 华梨 2 号 16. 宝珠梨 17. 苍溪雪梨 18. 灌阳雪梨 Fig. 1 The profile of S-al
14、lele-specific PCR fragments from 18 Japanese pears. The size of PCR fragment of S3 and S5-allele was the same. The lanes in each gel show, from left to right, M: DNA Marker DL 2000, 1: Imamuraaki (S1S6), 2: Kikusui (S2S4), 3: Housui (S3S5), 4: Okusankichi (S5S7), 5: Shinkou (S4S9), 6: Huali 1, 7: Sh
15、ounan, 8: Xizilu, 9: Xinhang, 10: Qingxiang, 11: Sanhua, 12: Huangmi (Imamuranatsu), 13: Huanghua, 14: Ninomiyahaku, 15: Huali 2, 16: Baozhuli, 17: Cangxixueli,18: Guanyangxueli , M: DNA Marker DL 2000. S 基因特异性限制性内切酶消化结果也进一步表明，今村秋、菊水、丰水、晚三吉及新兴 S 基因型分别为 S1S6、S2S4、S3S5、S5S7及 S4S9。其中，晚三吉 S5基因，其 PCR 扩增片段大小与丰水 S5同， 也能被限制性内切酶 PpuM （S3， S5） 消化 （图版- 4） ， 但不能被 AlwN（S5）消化（图版- 6） ，其原因不明。5 个 S 基因型已知的日本沙梨品种 PCR-RFLP 鉴定结果与已知结果相符，说明本试验所用方法是可靠的。 http:/ - 4 - 表 2 PCR-RFLP 技术鉴定的供试沙梨品种的 S 基因型 Table 2 S-genotypes of 18 Japanese pear cultivars determined
