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1、香港： (852)2100 6314 北京： (010)5806 9689 上海： (021)5257 4650-67337 广州： (020)8363 3828技 术 革 新 讲 坛13采 用检 测 荧 光 蛋 白 印 迹 系 统 的 多 重 荧 光 信 号采用 Ettan DIGE Imager 检测荧光蛋白印迹系统的多重荧光信号J. Goscinski and I. Gottschalk GE Healthcare, Uppsala, SwedenEttanTM DIGE Imager和 ECL PlexTM系统完全兼容，在灵 敏度、 线性和动态范围上和TyphoonTM扫描仪达到了相
2、同水平。在多重荧光应用上这两种扫描仪也有相似的 结果， 同一次蛋白印迹实验中检测两种蛋白时， 抗体或 者染料间的交叉反应降到最低。导言ECL Plex多重荧光蛋白印迹系统基于CyDyeTM偶联抗体 的灵敏度，能够高线性地在皮克 ( 10-12克) 范围进行检 测，动态范围几乎达到4个量级 ( 1，2) 。多重荧光检测 是ECL Plex系统另一个重要特点， 能够同时检测两种蛋 白质。在ECL Plex试验中， 数据的质量不仅仅取决于印迹， 还 要看所用的成像系统。现在，一种新的扫描 CCD 成像 系统，Ettan DIGE Image问世了。这是一款专门为双向 荧光差异凝胶电泳 ( 2-D D
3、IGE) 和 ECL Plex 系统而开发 的成像系统，能够生成CyTM2-，Cy3-，和Cy5标记的凝 胶和蛋白印迹的多通道图像。本研究比较了两种检测ECL Plex系统的扫描仪Typhoon 和新的Ettan DIGE Imager。 在多重荧光分析中， 分别用 HybondTM ECL ( 硝酸纤维素) 和新的低荧光Hybond-LFP ( PVDF) 膜检测两种CyDye偶联物。两种扫描仪的印迹 扫描结果相似，检测都很灵敏且动态范围宽。 应用ECL Plex系统检测TGF-活化的细胞， 也可见两种扫描仪都 能给出定量的数据。方法多重荧光模式系统把人类转铁蛋白 ( Calbiochem)
4、 和牛心肌肌动蛋白 ( Sigma-Algrich) 的蛋白质混合物上样到 NovexTM 12% Tris-glycine 凝胶 ( Invitrogen) ，转铁蛋白四倍稀释上样 量从5 ng到1.2 pg， 肌动蛋白两倍稀释上样量从150 ng 到2.34 ng。用miniVE垂直电泳系统，100 V，电泳2.5 小时。电泳分离完毕后， 采用TE 22 Mini小型全湿转印系统在 25 V电压下用2.5小时将蛋白转印到Hybond ECL ( 低荧 光硝酸纤维素) 或者 Hybond-LFP ( 低荧光 PVDF) 膜上， 然后，用 PBS + 0.1% TweenTM 20 ( PBS
5、T) 的封闭液 4 C 过夜孵育。封闭后，把蛋白膜用“兔抗人”转铁蛋白 (Dako Cytomation) 和“鼠抗牛”肌动蛋白 ( Sigma-Algrich) 一 抗混合物 ( 用PBST稀释到1:750) 室温孵育1.5小时。用 PBST洗涤后，把蛋白膜放在 ECL Plex Cy5偶联的羊抗 兔IgG和 ECL Plex Cy3 偶联的羊抗鼠 IgG ( 都用PBST稀 释到1:2500) 二抗混合物中， 在侧摆摇床上室温蔽光孵 育 1小时。然后把蛋白膜在 Ettan DIGE Imager和 Typhoon 多功能 扫描仪上扫描， 使用Cy3和Cy5适合的波长和滤光器用 Typhoo
6、n一次扫描。分析两种 CyDye 偶联抗体的检测 极限和交叉反应。多重荧光应用TGF- 是一种有效的生长因子，可以刺激多种细胞效 应，如生长抑制、细胞分化和凋亡。这里用TGF-活化 人类T293肾上皮细胞，并在不同时间点收获细胞。准 备这些细胞的裂解液，凝胶电涌分离，转印到Hybond ECL和Hybond-LFP膜上，然后按照前述步骤进行抗体 杂交， 靶蛋白是p38的磷酸化构型 ( pp38) ， 它是一个介 导TGF-活化功能的低丰度蛋白。 一抗是抗肌动蛋白的 单克隆抗体 ( Sigma-Aldrich) 和磷酸化-p38 MAP激酶抗 体 ( Cell Signalling) ，对应的二
7、抗分别为ECL Plex Cy3偶 联的羊抗鼠 IgG和 ECL Plex Cy5 偶联的羊抗兔 IgG。结果和讨论模式系统用ECL Plex Cy3偶联的羊抗鼠IgG和ECL Plex Cy5偶联 的羊抗兔IgG荧光抗体混合物在同一次蛋白印迹中同时 检测肌动蛋白和转铁蛋白。 分别在两种膜( Hybond ECL 和 Hybond-LFP) 上进行杂交，每种膜都分别在 Ettan DIGE Imager和Typhoon扫描仪上扫描。图1显示了来 自Cy3 ( 绿) 和Cy5 ( 红) 两个通道的叠加图。Ettan DIGE Imager 和 Typhoon 扫描仪的检测极限相同，证明了 Ett
8、an DIGE Imager 的性能很高。14香港： (852)2100 6314 北京： (010)5806 9689 上海： (021)5257 4650-67337 广州： (020)8363 3828图1. ECL Plex 多重荧光模式系统，将转铁蛋白 ( Tf) 和肌动蛋 白 ( Ac) 转印到Hybond-LFP和Hybond ECL 膜上。同时用ECL Plex Cy3偶联的羊抗鼠IgG和ECL Plex Cy5偶联的羊抗兔IgG 检测。蛋白膜用Ettan DIGE Imager ( 上) 和Typhoon 9410 ( 下) 进行扫描。再将Cy3和Cy5通道的图像叠加。应用除
9、了多重荧光模式系统外，我们还检测了两种扫描仪 的多重荧光应用。图 2 显示的是 ECL Plex 系统应用于 TGF-介导的磷酸化的检测结果。一株TGF-活化的细 胞系用肌动蛋白和pp38的抗体探测，指示p38的磷酸 化程度。 对活化量也进行了检测， 结果可见TGF-刺激 的时间越长 pp38 越多。比较 Ettan DIGE Imager 和 Typhoon 扫描仪的结果可知，二者都能给出定量数据 ( 图2) 。 这些结果清晰地表明ECL Plex系统和Ettan DIGE Imager 相结合具有强大的定量检测功能。结论EttanDIGE Imager的良好性能已得到充分的证实。 Etta
10、n DIGE Imager和ECL Plex系统完全兼容。Ettan DIGE Im- ager 拥有和Typhoon 扫描仪相似或者说是相同水平的 检测极限。 在多重荧光应用中， Ettan DIGE Imager的性 能可以和 Typhoon 扫描仪媲美。参考文献1. Application note: Multiplex protein detection using the ECL Plex fluorescent Western blotting system, 28- 4015-40, Edition AA (2005). 2. Application note: Multiple
11、x protein detection with the ECL Plex fluorescent Western blotting system using the Ettan DIGE Imager, 28-4041-97, Edition AA (2005).图2. 用TGF-刺激T293细胞0， 2.5， 5或者15分钟。 在Hybond- LFP膜上， 用牛肌动蛋白单克隆抗体和磷酸化p38MAP激酶抗 体， 分别检测总蛋白 ( 肌动蛋白) 和磷酸化的p38 ,再用相应的 ECL Plex 的二抗进行杂交。Ettan DIGE Imager( 上) 和Typhoon 扫描仪 ( 下)
12、显示Cy3 ( 绿) 和Cy5 ( 红) 叠加图。下面的图表是 每个泳道分别用肌动蛋白总量归一化后，pp38相对强度。订购信息产品货号ECL Plex Cy3 偶联的羊抗鼠IgG，150 gPA43009 ECL Plex Cy5 偶联的羊抗兔IgG，150 gPA45011 Hybond ECL，20 cm 3 mRPN203D Hybond-LFP，20 20 cm，10张RPN2020LFP miniVE垂直电泳系统80-6418-77 EPS 301 电泳仪18-1130-01 TE 22 小型全湿蛋白印迹系统80-6204-26 Ettan DIGE Imager，包括安装工具63-0056-42 Ettan DIGE Imager Cassette，11-0027-33 带低荧光玻璃，用于裸胶 Typhoon 94109410-PC ( 包括ImageQuantTM TL 软件)
