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1、 NADP-苹果酸酶（Malic enzyme ，NADP-ME）试剂盒说明书 分光光度法 50 管/48 样 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： ME 广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME 催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和 CO2，以及伴随 NAD(P)+的还原反应，是苹 果酸代谢的关键酶。 ME 活性与生物合成和抗氧化密切相关。 近年来植物 ME 活性测定较多， 已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将 ME 分为 NAD-ME(EC1.1.1.38)和 NADP-ME(EC1.1.
2、1.40)。 测定原理： NADP-ME 催化 NADP+还原成 NADPH，在 340nm下测定 NADPH 增加速率。 需自备的仪器和用品: 紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：60mL1 瓶，4保存。 ； 试剂一：液体 40mL1 瓶，4保存； 试剂二：液体 20mL1 瓶，4保存； 试剂三：粉剂1 支，4保存；用时加 2mL 蒸馏水充分溶解备用；溶解后 4可保存一周； 试剂四：粉剂1 支，-20保存；用时加 1mL 蒸馏水充分溶解备用；现配现用； 样本的前处理： 1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：
3、先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （104个） ：提取液体积（mL）为 5001000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提 取液） ， 超声波破碎细菌或细胞 （冰浴， 功率 20或 200W， 超声 3s， 间隔 10s， 重复 30 次） ； 8000g 4离心 10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g） ：提取液体积(mL)为 1：510 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液） ，进行冰浴匀浆。8000g 4离心 10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）样品：直接检测。 测定步骤： 1、 分光光度
4、计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。 2、 将试剂一、二、三和四置于 37（哺乳动物）或 25（其它物种）水浴 10min 以上。 如果一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三和四按下表比例配成混合液后置于 37 （哺乳动物）或 25（其它物种）水浴 10min 以上（混合液现配现用） 。 3、 操作表： 试剂名称（L） 测定管 试剂一 600 试剂二 225 试剂三 30 试剂四 15 样本 30 将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，混匀，立即记录 340 nm波长下初始吸光度 A1 和反应 1min 后的吸光度 A2，计算 A=A2-A1。 注意：如果 A
5、0.005，可将反应时间延长到 2 分钟或 5 分钟。 NADP-ME 活性计算： （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADP-ME（nmol/min/mg prot）AV 反总（d）109(V 样Cpr) T= 4823ACpr 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。 （2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADP-ME（nmol/min/g 鲜重）AV 反总（d）109(W V 样V 样总) T = 4823AW （3）按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADP-ME （nmol/min /104 cell） =AV 反总 （d） 109(500V 样V 样总) T =9.646A V 反总：反应体系总体积，910-4 L；：NADPH 摩尔消光系数，6.22103 L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.03 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总 数，500 万。
