悬浮培养乳腺癌干细胞放疗抵抗与g2期阻滞相关

《悬浮培养乳腺癌干细胞放疗抵抗与g2期阻滞相关》由会员分享，可在线阅读，更多相关《悬浮培养乳腺癌干细胞放疗抵抗与g2期阻滞相关（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、 基础研究 悬浮培养乳腺癌干细胞放疗抵抗与G2期阻滞相关田允鸿， 谢国柱， 任 陈， 孙权权， 孙爱民， 刘 英， 袁亚维南方医科大学南方医院放疗科， 广东 广州 510515摘要： 目的 悬浮培养富集MCF-7细胞系中乳腺癌干细胞， 探讨其细胞周期与放疗抵抗关系。 方法 无血清悬浮培养体系 富集MCF-7细胞系中肿瘤干细胞， 体内成瘤实验验证其干细胞特性， 克隆形成检测其辐射敏感性； 进一步流式细胞仪分 析放疗前后其细胞周期变化， 蛋白印记法测定放疗前后pCDC25C(ser216)蛋白含量。 结果 无血清悬浮培养富集的乳腺 癌干细胞体内成瘤能力明显强于贴壁培养细胞； 乳腺癌干细胞和贴壁培养

2、细胞SF2Gy分别为0.8560.061和0.7830.097 (P50个细胞的克隆数。照射方法： 6MV X线， 源皮距100 cm， 剂量率300 cGy/min， 照射野100 mm100 mm。1.5 细胞周期检测为了减少球囊形态及悬浮培养基中生长因子对结果的影响， 取指数生长期的贴壁培养细胞和1周球囊制成单细胞悬液， 调整密度至3105细胞/ml， 分别接种于含生长因子的血清培养基 （贴壁细胞） 和含生长因子的无血清培养基 （乳腺癌干细胞） 的 6 孔板中。3 h后给予2Gy照射， 继续培养24 h后收获细胞，70%乙醇固定12 h， 加入RNA酶和PI染液， 30 min后 流式检

3、测。1.6Western blotting 检 测 CDC25C 和 pCDC25C(ser216)蛋白表达水平2Gy照射后24 h细胞总蛋白提取及浓度检测方法依据德国Novagen公司全蛋白提取试剂盒说明书操作。细胞总蛋白与上样缓冲液按2 1混合， 煮沸5min。经SDS-PAGE分离， 电转到硝酸纤维膜上， 孵育一抗、 二抗后暗室显影曝光， Gel2000 成像系统（Bio-Rad） 分析灰度。1.7 统计方法实验结果应用SPSS 13.0 软件， 计量资料采用均 数标准差， 以独立样本 t 检验及方差分析进行统计分析， P0.05)。图2 克隆形成实验比较球囊细胞与贴壁MCF-7细胞放疗

4、敏感性Fig.2 Clonogenic assay following radiation for radiosensitivityassessment of purified mammosphere cells compared with themonolayer cells.10.10.010.001Mamoshprer Monolayer0246810 Dose(Gy)Survival fraction图3 贴壁培养放疗前 （A） 、 放疗后 （B） 和球囊细胞放疗前 （C） 、 放疗后 （D） 细胞周期结果Fig.3 Radiation-induced cell cycle chang

5、es of the monolayer cells and mamosphere cells. A, C:Before radiotherapy; B, D: After radiotherapy.%G1=57.0%G2=8.0%S=35.0%G1=70.4%G2=6.3%S=23.3%G1=49.4%G2=13.0%S=37.6%G1=34.6%G2=43.3%S=22.110008006004002000Cell Number04080120160200240 DNAContent04080120160200240 DNAContent720640560480400320240160800

6、Cell Number9008007006005004003002001000Cell Number04080120160 200 240 DNAContent560480400320240160800Cell Number04080120160200240 DNAContentABCD3 讨论 肿瘤干细胞 （CSCs） 是放化疗抵抗、 转移和复发的根源。体内成瘤实验成为验证肿瘤干细胞的金标准5。2003 年， Al-Hajj1等人分离出表面标记物为CD44+CD24-/low的乳腺癌干细胞， 随后， Ponti6和Cari-ati7等人利用悬浮培养成功富集乳腺癌干细胞。因 此， 我们采用悬浮

7、培养富集乳腺癌干细胞， 体内成瘤实验验其证干细胞特性。实验结果证实悬浮培养第7天可见由上百个细胞组成的球囊 （图1） 。体内成瘤结果显示球囊细胞成瘤能力明显强于贴壁培养 （表 1） 。图 4 Western blotting 检测贴壁培养和悬浮培养放疗前后CDC25C和pCDC25C （ser216） 含量Fig.4Protein expression of CDC25C and pCDC25C(ser216)measured by Western blotting.CDC25CGADPHIR pCDC25C (ser216)monolayermamosohere +-+-田允鸿, 等.悬浮培

8、养乳腺癌干细胞放疗抵抗与G2期阻滞相关第1期 55Diehn8等人和Baumann9等人研究发现肿瘤干 细胞放疗抵抗， 谢国柱等人4报道放疗能富集肿瘤干细胞。临床实践亦证实含有大量未分化细胞的肿瘤复发几率明显增高。因此， 我们对所获得的肿瘤干细胞放疗敏感性进行研究， 结果证实乳腺癌干细胞比贴壁培养乳腺癌细胞具有更强的放疗抵抗特性 （图2） ： 悬浮培养乳腺癌干细胞亚致死损伤修复能力较强 （Dq） ； 高剂量处放疗敏感性低 （D0） ； 2Gy照射后存活分数较高(SF2Gy)。2004年， Kastan10等报道DNA受到损伤时， 可通过几个监测点启动细胞周期延迟或阻滞， 以利于DNA修复。这种

9、周期阻滞在正常细胞中是一种有利的保护机制， 但在肿瘤细胞中周期阻滞可能会增强细胞的放射性抵抗。因此， 为进一步了解乳腺癌干细胞放疗抵抗机制， 我们对其细胞周期进行分析， 结果显示贴壁培养细胞放疗前后各 细胞周期无明显变化， 而悬浮球囊中G2/M期细胞含量在放疗后显著增加(P0.001， 图3)。研究显示， 在细胞从G2期向M期转化过程中， 磷酸化的CDC25C（pCDC25C） 起重要作用： 磷酸化的CDC25C与胞质蛋白14-3-3结合， 被 “锚定” 在胞质不能进入细胞核，最终导致 G2/M 期阻滞11。因此， 我们进一步对pCDC25C(ser216)蛋白进行检测， 结果显示pCDC25

10、C(ser216)蛋白在悬浮培养细胞群中放疗后含量明显上升而贴壁培养细胞群中放疗前后无明显变化(图4)。总之， 悬浮培养乳腺癌干细胞放疗抵抗， 放疗后出现G2期阻滞， 且伴G2期相关蛋白pCDC25C(ser216)含量上升。尽管我们知道肿瘤干细胞具有放疗抵抗特性，但我们并不清楚其机制， 且目前国内外尚未见乳腺 癌干细胞放疗抵抗与细胞周期关系的报道。因此，我们对细胞周期与放疗抵抗关系进行研究。实验发 现肿瘤干细胞放疗抵抗与G2期阻滞相关， 且伴G2期相关蛋白pCDC25C(ser216)含量上升。目前针对肿瘤的治疗虽能使肿瘤体积明显缩小， 但残余的肿瘤干细胞将导致肿瘤治疗容易失败， 因此针对肿

11、瘤干细胞的治疗将是更有效的手段。而我们对肿瘤干细胞放疗抵机制的研究将能为肿瘤治疗提供新的希望， pCDC25C(ser216)蛋白含量的变化为以肿瘤干细胞为目标的治疗提供可行的靶点。参考文献：1 Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, et al. Prospectiveidentification of tumorigenic breast cancer cellsJ . Proc NatlAcad Sci USA, 2003, 100(7): 3983-8.2 Phillips TM, Mcbride WH, Pajonk F. The respo

12、nse of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation J . J Natl CancerInst, 2006, 98(24): 1777-85.3 高庆蕾, 叶 飞, 谢大兴, 等. 灭活细胞周期检测点激酶增强乳腺癌细胞放疗敏感性 J . 中国妇幼保健, 2008, 23(28): 4026-8.4 谢国柱, 詹军芳, 孙爱民, 等. 辐射与悬浮球培养联合纯化乳腺癌干细胞 J . 实用医学杂志, 2010(11): 1893-6.5 Grimshaw MJ, Cooper L, Papazisis K, et

13、al. Mammosphere cultureof metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breastcancer cells J . Breast Cancer Res, 2008, 10(3): R52.6 Ponti D, Zaffaroni N, Capelli C, et al. Breast cancer stem cells: anoverview J . Eur J Cancer, 2006, 42(9): 1219-24.7 Cariati M, Purushotham AD. Stem cells a

14、nd breast cancerJ .Histopathology, 2008, 52(1): 99-107.8 Diehn M, Cho RW, Lobo NA, et al. Association of reactive oxygenspecies levels and radioresistance in cancer stem cells J . Nature,2009, 458(7239): 780-3.9 Baumann M, Krause M, Hill R. Exploring the role of cancer stemcells in radioresistance J

15、 . Nat Rev Cancer, 2008, 8(7): 545-54.10Kastan MB, Bartek J. Cell-cycle checkpoints and cancerJ .Nature, 2004, 432(7015): 316-23.11Furnari B, Blasina A, Boddy MN, et al. Cdc25 inhibited in vivoand in vitro by checkpoint kinases Cds1 and Chk1J . Mol BiolCell, 1999, 10(4): 833-45. （编辑： 吴锦雅）南方医科大学学报(J South Med Univ)第31卷 56