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1、Make your qPCR REAL-From principles to applications Dr. LJ Zhang, 2013 Vazyme, ChinaReal-time PCR (qPCR) Real-time PCR优势 Real-time PCR检测原理与常用名词 基本原理 (数学/化学) 应用相对定量绝对定量 PCR定量qPCR 宏基因组单个基因（表达） PCR定量qPCR PCR定量qPCR N = N0 x 2n PCR定量qPCR N = N0 x 2n （2，扩增效率），扩增效率） PCR定量qPCR N = N0 x 2n非指数扩增期指数扩增期N = N0 x
2、 1.9nN = N0 x 1.8nN = N0 x 1.7n。 PCR定量qPCR N = N0 x 2n非指数扩增期指数扩增期N = N0 x 1.9nN = N0 x 1.8nN = N0 x 1.7n。检测灵敏度平台期指数期指数期线性期平台期qPCR 指数期指数期N = N0 x 2n比较不同样品间某基因的量Choice 1（半定量PCR）: N = N0 x 2n 等循环数（n）， N0 = N / 2n Choice 2（qPCR）: N = N0 x 2n 等产物量（N）， LgN0 = n x Lg2 + LgN qPCR 指数期指数期N = N0 x 2nChoice 1（半
3、定量PCR）Choice 2（qPCR）半定量PCR VS qPCRqPCR 显著差异 差异微弱Choice 1 半定量PCR半定量PCR VS qPCRqPCR 显著差异Choice 2 qPCR半定量PCR VS qPCR差异显著！qPCR 没有差异 显著差异Choice 2 qPCRChoice 1 半定量PCR 半定量PCR（等n）重现性差、定量“失真” qPCR（等N）重现性好、定量“天然”qPCR荧光定量PCR实时定量PCR。qPCR 对数期等对数期等N定量定量qPCR 等N测定方式 (Real-time，实时) PCR阶段划分线性图谱对数图谱qPCR 基线、阈值、CT值线性图谱对
4、数图谱qPCR 基线、阈值、CT值基线SD X10， 10-5qPCR 基线、阈值、CT值线性图谱对数图谱基线期与指数期基线期与指数期 接合部接合部 扩增曲线与阈值扩增曲线与阈值 的交点的交点qPCRqPCR 基本原理基本原理化学原理： 变“N”为荧光，测定荧光值反应“N”的量数学原理： 通过循环数“n”（Ct值）来计算N0 qPCR 化学原理化学原理化学原理： 变“N”为荧光，测定荧光值反应“N”的量DNA的荧光标记 (染料、荧光基团) 1. Hydrolysis probes(TaqMan, Beacons) 2. Hybridization or FRET probes(Light Cy
5、cler) 3. DNA-binding (intercalating) agents(SYBR Green, Eva Green, LC Green)qPCR 化学原理化学原理荧光 (染料、荧光基团)SYBRTaqManqPCR 化学原理化学原理 SYBR一种DNA小沟非饱和性结合染料与DNA结合时发光/不结合(游离)时不发光每形成一条DNA双链，就会有一定数量的染料结合上去染料一结合，就会产生荧光信号信号强度与DNA分子总数目成正比qPCR 化学原理化学原理 TaqMan Probe一种水解探针(5 Reporter, 3 Quencher)完整时不发光/水解后发光每形成一条DNA链，就会
6、水解一条探针每水解一条探针，就会产生一个单位信号信号强度与结合过探针的DNA分子总数目成正比qPCR 化学原理化学原理 SYBR VS TaqMan ProbeSYBRTaqManAssays that requires low specificity Assays that requires high specificity Detection of gene expressed at high levelDetection of rare transcriptsGeneral screening of transcripts prior to moving to probe based a
7、ssaysLow level pathogen detectionMultiplex reactionsAllelic discrimination assays qPCR 数学原理数学原理 数学原理： 通过循环数“n”（Ct值）来计算N0 起始DNA量 VS CTqPCR 数学原理数学原理N = N0 x 2nqPCR 数学原理数学原理N = N0(1+e)nN产物分子数N0起始分子数e扩增效率n循环数qPCR 数学原理数学原理 定量数学原理， DNA量 VS CT？qPCR 数学原理数学原理 定量数学原理， DNA量 VS CT？qPCR 数学原理数学原理 定量数学原理， DNA量 VS
8、CT？qPCR 应用应用 绝对定量 相对定量 等位基因型分析 阴阳性鉴定 Micro RNA分析。qPCR 应用应用- -绝对定量绝对定量 根据标准品，测定样品中基因表达量的绝对值xxx 个拷贝qPCR 应用应用- -绝对定量绝对定量 根据标准品，测定样品中基因表达量的绝对值xxx 个拷贝qPCR 应用应用- -绝对定量绝对定量 根据标准品，测定样品中基因表达量的绝对值xxx 个拷贝qPCR 应用应用- -绝对定量绝对定量 根据标准品，测定样品中基因表达量的绝对值xxx 个拷贝qPCR 应用应用- -相对定量相对定量 测定不同样品中基因表达量的相对值xxx 倍Sample 1 Sample 2
9、 Ct: 25 Ct: 26 基因表达量Sample 1 /Sample 2 = 2 Ct: -1 qPCR 应用应用- -相对定量相对定量 测定不同样品中基因表达量的相对值xxx 倍样本量差异-RNA差异-逆转录差异-cDNA差异 Calibrator！(内参，Normalizer)Sample 1 Sample 2 Ct: 25 Ct: 26 基因表达量Sample 1 /Sample 2 = 2 Ct: -1 qPCR 应用应用- -相对定量相对定量 测定不同样品中基因表达量的相对值xxx 倍Sample 1 Sample 2 Ct: 25 Ct: 26 内参Ct: 20 内参Ct: 2
10、2 Ct: 5 Ct: 4 Ct： 1基因表达量Sample 1 / Sample 2 = 1/2SYBR相对定量相对定量- -实验流程及注意事项实验流程及注意事项样品制备 RNA提取 RT-PCR 内参基因选择 引物设计 引物有效性检测 qPCR 数据处理不要轻易相信qPCR数据！SYBR相对定量相对定量- -实验流程及注意事项实验流程及注意事项样品制备 RNA提取 RT-PCR 内参基因选择 引物设计 引物有效性检测 qPCR 数据处理样品制备（细胞、组织）对照设置！对照设置！ 后期数据有效性分析重要指标阴性对照 阳性对照 实验组SYBR相对定量相对定量- -实验流程及注意事项实验流程及注
11、意事项样品制备 RNA提取 RT-PCR 内参基因选择 引物设计 引物有效性检测 qPCR 数据处理如前所述注意事项 RNA完整性、纯度 逆转录模板用量尽可能一致 cDNA质量（普通PCR测定） 基因组污染情况（NRT对照）SYBR相对定量相对定量- -实验流程及注意事项实验流程及注意事项样品制备 RNA提取 RT-PCR 内参基因选择 引物设计 引物有效性检测 qPCR 数据处理始终选择表达充沛、均一的基因做为内参基因 不要盲目选择常用的内参基因 最好能够通过实验确认样品处理方式对所选内参基因的表达无影响常用内参基因 GAPDH，Actin，Tublin 18s （无Poly A tail）
12、SYBR相对定量相对定量- -实验流程及注意事项实验流程及注意事项样品制备 RNA提取 RT-PCR 内参基因选择 引物设计 引物有效性检测 qPCR 数据处理成功关键！成功关键！ 引物长度（17 bp-25 bp） 产物长度100 200 bp 3端应尽量避免高GC或高AT含量区域。 3端最后一个碱基最好为G或者C，避免使用T。 正反向引物的Tm值最好相差不要超过1。 GC含量（40%-60%） 引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀 避开T/C或者A/G的连续结构 避开引物内部或者两条引物之间的互补序列 NCBI BLAST23对SYBR相对定量相对定量- -实验流程及注意事项实验流程及注意
13、事项样品制备 RNA提取 RT-PCR 内参基因选择 引物设计 引物有效性检测 qPCR 数据处理好的开始是成功的一半！好的开始是成功的一半！ 扩增特异性 有无二聚体 扩增效率计算常用二聚体去除方法 提高模板浓度 降低引物使用量 提高退火温度 改两步法为三步法SYBR相对定量相对定量- -实验流程及注意事项实验流程及注意事项样品制备 RNA提取 RT-PCR 内参基因选择 引物设计 引物有效性检测 qPCR 数据处理硬件配置要过硬！硬件配置要过硬！移液器、枪头、qPCR管、定量仪器注意事项：注意事项： 准确移液 至少3重复（统计要求） 模板稀释后以大体积加入反应体系 尽可能不使用边上的孔防污染
14、常规方法：防污染常规方法： 模板制备、反应体系配制、反应区、电泳区物理隔离 超净工作台关风 使用过的枪头、EP管密封存放 使用带滤芯的枪头 移液器专用SYBR相对定量相对定量- -实验流程及注意事项实验流程及注意事项样品制备 RNA提取 RT-PCR 内参基因选择 引物设计 引物有效性检测 qPCR 数据处理反应有效性确认反应有效性确认扩增曲线3复孔重复性良好，NTC在30循环内无扩增曲线出现 熔解曲线单峰，峰前后曲线平坦SYBR相对定量相对定量- -实验流程及注意事项实验流程及注意事项样品制备 RNA提取 RT-PCR 内参基因选择 引物设计 引物有效性检测 qPCR 数据处理2- Ct法法
15、设定引物扩增效率为1，即PCR每循环产物量翻倍 则 Xn=X0 2n X0=Xn/2n 设定定量样品为A和B，基因表达量分别为A0, B0 则 A0=An/2n ， B0=Bn/2n依据SYBR定量原理，荧光信号正比于PCR产物量。现制定一个荧 光信号阈值（threshold），标记此时的产物量为T。则，当荧光信 号达到设定的阈值时所经历的循环数即为Ct值。此时 A0=T/2CtA ， B0=T/2CtB此时比较样品B和A中起始基因表达量的差异可得如下公式：B0/A0 = (T/2CtB)/(T/2CtA) = (1/2CtB)/(1/2CtA) = 2CtA/2CtB = 2CtA-CtB = 2-(CtB-CtA) (2 -Ct)SYBR相对定量相对定量- -实验流程及注意事项实验流程及注意事项样品制备 RNA提取 RT-PCR 内参基因选择 引物设计 引物有效性检测 qPCR 数据处理2- Ct法法为消除样品cDNA浓度差异，引入内参基因进行
