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1、 1997年3月26日收到吖啶酯标记的化学发光免疫分析优化参数评价金 坚 管 玲 王博成 罗世能( 核医学国家重点实验室, 无锡 214063)摘 要以睾酮- 3-羧甲氧基肟- 牛血清白蛋白为免疫原, 免疫家兔产生抗血清, 10- 甲基吖啶-9- 羧酸 4-( N- 睾酮- 3- 羧甲氧基肟) -氨乙基 苯酯为示踪化合物, 采用平衡法建立睾酮化学发 光免疫分析, 数据用四参数 Logistic 函数处理. 方法学考核标准曲线稳定, R 为0. 9967; ED50为82. 15ng/L; 批内和批间CV分别为5. 78% 和3. 3% ; 平均回收率为107. 28% ; 可测范 围为19.
2、3264. 6ng/L, 与雌酮、雌二醇、雌三醇和孕酮的交叉反应率均小于1. 35% ; 非特 异结合率为9. 64% . “ 桥效应”分析表明同位点、“ 桥”结构相同亲和力最大.关键词 吖啶酯, 睾酮, 化学发光, 免疫分析, 参数1 引 言生物体液中物质的测定通常包括反应和测定两个步骤, 其性质可以是物理的、化学的、 生物学的或免疫学的. 后者利用抗原和抗体特异性结合的特性, 发展成为各种示踪 体系的免疫分析技术. 化学发光( CL) 具有灵敏和线性范围宽等优点, 被认为是替代放射免疫分析的主要方法之一 1. 吖啶酯类化合物发光效率高, 光猝灭效应小, 反应条件温和, 不受连接臂长短的影响
3、, 受到免疫化学工作者的关注 2. 作者在合成和评价了吖啶-9-羧酸 ( 4-氨乙基) -苯酯 ( AEPAC) 3、10-甲基吖啶-9-羧酸 4- ( N- 睾酮-3-羧甲氧基肟) -氨乙基苯酯 ( To-3-AEPMAC) 4、CL 测量参数和睾酮抗体工作浓度优化的基础上 5, 就其建立 CL 免疫分析 ( CLIA) 优化条件的参数进行了分析.2 材料与方法2. 1 主要试剂To-3-AEPMAC 由本实验室合成. 睾酮 ( To) 、雌酮 ( E0) 、孕酮 ( P0) 、雌二醇( E2) 、雌三醇 ( E3) 和抗睾酮-7A -牛血清白蛋白兔血清 ( 7A -AT S) , Sigm
4、a 产品. 抗睾酮-3-羧甲基肟-牛血清白蛋白兔血清 ( 3-CMO-AT S) 由上海市内分泌研究所提供 6. 无水二甲基甲酰胺 ( DMF) , Pharmacia 产品. 白明胶为 Serva 产品. 免疫化学分析用活性碳和葡聚糖由世界卫生组织提供. 其它试剂均为国产分析纯. 2. 2 To-3-CMO-AEPMAC的 CL 测量参照文献 4 进行.第18卷 第3期1997年9月发 光 学 报 CHINESE JOU RNAL OF LU MINESCENCEVol. 18 No. 3 Sept. , 1997 2.3 3-CMO-ATS 工作浓度优化分析参照文献 5 进行.2.4 To
5、-CLIA以含0. 1% 白明胶, 0. 155 mol/ L NaCl 的0. 1 mol/ L Na2HPO4-Na2H2PO4pH 6. 0为 反应缓冲液, DMF: 0. 1 mol/ L HCl 为母液, To 标准浓度点为0、10、25、 50、 100、 150、200和250 ng/ L, 采用平衡法建立 T o-CLIA. 反应试管中, 依次加入由母液与反应缓冲液14( V/ V) 配制的T o 标准50 Ll, 118000稀释的3- CMO-ATS 100 Ll, 母液溶解的T o-CMO-AEPMAC 100 L l ( 104. 47 pg, 0. 3628 pmol
6、) , 4 反应16 小时. 于冰浴中加入 0. 5% 白明胶100 Ll 和用葡聚糖包裹的活性碳 ( 110, W/ W) 500 L l, 持续振荡10 min,3000r/ min 离心10 min ( J6-HC, Backman) . 取上清0. 5 ml 进行 CL 检测, 触发反应液为50 Ll 含26. 8 mmol H2O2和300 Ll 含0. 2 mol/ L NaOH 溶液, 延迟时间为0. 30 s, 积分时 间为10 s( Luminometer 1251002c, 1291, LKB; Hewlett Packard 3390 A) . 以未加T o 和3-CMO
7、- AT S 的测量管为对照.2.5 数据处理方法 本文曲线拟合用四参数 Logistic 和自动样条函数数据处理程序处理 7, 8.图1 睾酮化学发光免疫分析标准曲线Fig.1 Standard curve for the chemilumi-nescenceimmunoassayoftesto-sterone.3 结 果3.1 To-CLIA 标准曲线经四参数 Logistic 函数处理, To-CLIA标准曲线示于图1. 曲线拟合方程为:Y =a - d1+ (x c)b+ dx 为 T o 量; Y 为3-CMO- ATS 结合 T o-3-CMO-AEPMAC 的量, a 为曲线上渐
8、近线估 计值, 取零标准点 To-3-CMO-AEPMAC 的结合量; b 为曲线的平均斜率由 log-logit 法 求出; c 为剂量结合率与零剂量点结合率为50%时相应的 T o 量; d 为曲线下渐近线估计量, 取非特异结合 To-3-CMO-AEPMAC的量. 本 文 T o-CLIA 标 准 曲 线 的 a 为95. 6549, b 为1. 6166, c 为8, d 为5344. 5, R 为0. 9967.3.2 灵敏度分析 以零标准管的积分值均数 ( n= 10) 减去2SD, 代入T o-CLIA 标准曲线方程, 计算 x为5. 69 ng/ L.259第3期金 坚等: 吖
9、啶酯标记的化学发光免疫分析优化参数评价 3.3 精密度分析( 1) 以100 ng/ L 为内质控标本, 每次作三份复管, 连续作四批测定, 结果见表1.表1 To CLIA 批内和批间 CV误差分析T able. 1 Analization for intraand inter- assay CV of T o- CLIA.实验批号测定值X1X2X3X-批间误差SDCV%190. 1285. 2491. 5488. 973. 303. 71282. 6289. 7795. 0289. 146. 226. 98383. 3288. 6693. 7088. 565. 195. 86490. 44
10、83. 9194. 6689. 675. 426. 04均值 (M) 89. 09总误差 ( SDT)0. 46平均批内CVw% 和批间CVb% 计算:SDw=6SD2 i/ M = 5. 15 CVw% = ( SDw/ M) 100% = 5. 78 SDb=SD2T- SD2w/ 复管数 = 2. 94CVb% = ( SDb/ M) 100% = 3. 30 图2 睾酮化学发光免疫分析精密度图 Fig. 2 The precision profile for the chemilu- minescence immunoassayof testos- terone.The best pr
11、ecision was ob- tained between 19. 3264. 6 ng/ L, with a progressive deterioration to-wards the extremes of the range.( 2) 以标准管对数剂量对相应 CV% 作精密度图, 曲线拟合采用样条函数处理, 即:xnx0g( x)2dxmin=xnx0f( x)2dx. 对于各标准管数据组 ( xi, Yi) , i= 0、1n, g ( x) 为 x0,xn 区间保持二阶导数的函数, 所有 g ( x) 满足平滑条件函数 f ( x) 为6ni= 0(g( xi) - Yi DYi
12、)2S , 而 f ( x ) 在各段的表达式为 f ( x) = ai+bi( x - xi) + ci( x - xi)2+ di( x - xi)3的分段三次多项式, 拟合用牛顿迭代法 ( 图2) . 取CV%10% 对应的 x 坐标闭区间为可测范围: 19. 3264. 6 ng/ L.3.4 准确度分析 以10 ng/ L 标准管为基础, 分别加入50ng/ L, 100 ng/ L 和150 ng/ L 标准, T o-CLIA 测量结果和平均回收率见表2:260 发 光 学 报第18卷表2 To CLIA回收试验Table. 2 Recovery experiment of To
13、 CLIA.加入To量理论值测定值回收率ng/Lng/Lng/L( % )01014. 40144506058. 6097. 6710011094. 2585. 68150160162. 83101. 77平均回收率107. 283.5 特异性分析图3 雌酮、孕酮、雌二醇和雌三醇对睾酮化学发光免疫分析的抑制效应Fig.3 Assessment of specific Non-specificity forchemiluminescenceimmunoassayoftestosterone.T he cross-reacting materialswere chosen,such as estr
14、one,proges-terone, estrodiol and estriol.将 E0、 P0、 E2和E3用反应缓冲液配成1004000 ng/ L 一系列不同浓度, 代替To CLIA 标准曲线的 T o 参考标准. 在上 述浓度范围内, 它们对 T o-CMO- AEP-MAC 和3-CMO-AT S 之间的结合分别有0. 64% , 0. 07%, 1. 33%和0. 05% 的抑制 ( 图3) .3.6 稳定性分析( 1) 零标准在工作浓度3-CMO-AT S条件时结合率为48. 8% , 表明示踪化合物 与抗血清孵育条件的选择是合理的; 非特异结合率为9. 64%, 显示活性碳
15、分离结合与游离 To-3-CMO-AEPMAC 是可行的. 示踪化合物存放3年, 上述参数无明显改变.( 2) 曲线拟合条件经线性二元一次方程, Log- Logit 函数, 3/ 2次函数、3次函数和四参数 Logistic 函数分析比较, 后者效果最好. ED25、ED50和 ED75分别为158. 15 ng/ L、 82. 15 ng/ L 和38. 21 ng/ L.3. 7 有效性分析18例正常男性血浆标本, 经碱性条件下 CH3Cl2淬取水洗和有限稀释后. To-CLIA检测, 含量为5. 251. 49 Lg/ L ( X-SD) , 范围为1. 419. 15 Lg/ L.3
16、.8 T o 不同位点 “ 桥效应”分析 以 To 为参考标准, To-3-CMO-BSA 为免疫原, To-3-AEPMAC 为示踪化合物,7A -AT S或3- CMO-ATS 为限量结合试剂分析显示, 当 “ 桥” 同为 CMO, 位点均在3位时,含 “ 桥”示踪化合物与抗体的亲和力明显大于7A -TAS 的亲和力 ( 图4) .261第3期金 坚等: 吖啶酯标记的化学发光免疫分析优化参数评价 图4 睾酮化学发光免疫分析 “ 桥效应”分析Fig. 4 Assessment of bridge effect to chemilumi-nescenceimmunoassayoftestosterone.Tracer ligand wastestosterone-3- CMO-AEPMAC, the binder,3-CM O-antibodyand7-A-antibody.4 讨 论已合成和发现的 CL 化合物很多, 可 用于免疫分析示踪的
