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1、http:/ - 1 - 川产羌活种质资源的川产羌活种质资源的 RAPD 分析分析* 唐学芳1，蒋舜媛2*，孙辉1，陈铁柱2，周毅2，马小军3 1. 四川大学环境科学与工程系，成都（610065） 2. 四川省中医药科学院生药研究所，成都（610041） 3. 中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京（100094) E-mail： 摘摘 要要：本文用 RAPD 方法选择 15 个随机引物对 33 株个体叶片 DNA 进行扩增，在种内多 态性水平、 个体间遗传关系及居群间遗传分化 3 个方面对羌活的遗传结构进行分析， 考察羌 活的遗传特征，探讨不同产地有形态变异的羌活（N.incis
2、um）种质资源的遗传多样性、遗传 分化。结果： （1）RAPD 共检测到 185 条谱带，其中 128 个位点为多态位点，羌活种内多态 性百分率为 69.19%，Neis 基因多样性为 0.2237，Shannons 信息指数为 0.3375； （2）紫秆、 绿秆、紫纹亚居群均按各自居群聚为一类，壤塘和九龙居群聚为一类，理县和泸定居群聚为 一类； （3）羌活居群内、亚居群间和居群间的变异分别占总变异的 71.67、4.52和 23.81 ；（4） 羌活居群间的遗传距离与地理距离间没有明显相关性 （r= -0.1105， P =0.58550.05） 。 结论： 本研究所用 3 个指标均表明羌活
3、种内遗传多样性水平较高； 羌活的遗传变异主要分布 在居群内，但居群间已形成一定的遗传分化； 壤塘和九龙羌活个体间的遗传距离较小，各 自遗传背景较为相似。 关键词关键词：羌活；RAPD；遗传多样性 中国分类号：中国分类号：R282.5 羌活（Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang）是伞形科（Umbelliferae）羌活属多年生草本植物，我国特有种1, 2，是常用中药羌活（Rhizome et Radix Notopterygii）的主要基源植物，也是传统商品“川羌”的主要来源。以干燥根茎和根入药，具有散寒祛风、除湿止痛的功效，用于风寒感冒头痛、风湿麻
4、痹、肩背酸痛等症3。羌活分布于川西高山峡谷和川西北高原、青海东南部、甘肃南部及西藏东南部等区域，生长在海拔 25004000m 的林缘、林窗、疏林、沟谷草丛和灌丛下，以海拔 30003700m 较集中，生长环境土壤有机质含量较高，一般有枯枝落叶层和腐殖质层，通透性良好，容量较小，土质较疏松4。由于长期依赖野生采挖，资源及其原生境破坏严重，理县、小金等川羌的传统道地产区已资源枯竭。1987 年即被国务院中国野生药材资源保护管理条例列为级保护物种，2005 年又载入中国物种红色名录5。 通常文献描述羌活花茎的颜色为紫色， 我们在进行羌活种质资源收集整理中观察到相同的生境下同时还存在绿色花秆，且性状
5、稳定。以及紫色条纹的过度类型。 目前，对羌活的研究主要是化学成分，药理作用的研究，以及对该属植物地理分布、形态学、孢粉学、分类学、环境土壤学、核型和驯化栽培等方面的研究12, 59，但从 DNA 分子水平上对羌活群体遗传结构、遗传分化及多样性研究至今尚未见报道。RAPD 分子标记技术作为一种简便、快速、易行的分子标记技术，近年来广泛应用于植物自然群体的遗传多样性研究10。 本文利用 RAPD 分子标记技术从 DNA 分子水平上分析 4 个地区羌活天然群体的遗传多样性、群体内和群体间的遗传变异及其与生态因子的相关性，为合理保护、利用和开发羌活遗传资源提供理论依据。 *本课题得到国家科技基础条件平
6、台项目“药用植物种质资源标准化整理、整合及共享试点” （2005DKA21004） 、国家环保总局 “中国重点药用生物资源调查” 项目资助。 http:/ - 2 - 1 材料与方法材料与方法 1.1 实验材料实验材料 2004 和 2006 年在四川甘孜州泸定、九龙和阿坝州的理县壤塘分单株采集羌活（N. incisum）当年萌发的新鲜幼嫩叶片，用硅胶快速干燥，编号备用，并按花茎颜色的显著差异分为 10 个亚居群，见表 1。居群 LX 和 LD 为原产地根茎移栽收集在种质资源圃通过无性繁殖的植株，其余为野生居群，野生采样个体距离在 1m 以上，以确保同一基因型不被重复采样。采样正值羌活开花期，
7、资源圃的植株物候期均早于野生居群。样品由四川省中医药科学院蒋舜媛博士鉴定。 表 1 羌活样品的来源及编号 Table 1 Source of Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang populations for RAPD analysis 居群 Pop 亚居群 Subpop. 茎颜色(编号)Stem Color ( No.) 来源 Sources 地理位置 Site 采集时间Time 年均温() Annual mean temperature 年降水量(mm)Annual rainfall LX I 紫纹(12) 阿坝州理县米亚罗 10244E 200
8、6.7 11.4 590 II 绿色(34) Mi Yaluo, Lixian, Aba 3152N Alt.3740m III 紫色(56) LD IV 紫色(79) 甘孜州泸定县 10212E 2006.7 12.4 636 V 绿色(1011) Luding, Ganzi 2963N Alt. 3600mJL VI 紫色(1216) 甘孜州九龙县洪坝乡 10153E 2006.8 8.8 892 VII 绿色(1720) Hong ba, Jiulong, Ganzi 2901N Alt. 3200mVIII 紫纹(2123) RT IX 紫色(2428) 阿坝州壤塘县阿斯玛乡 1010
9、7E 2004.9 4.7 756 X 绿色(2933) A Sima, Rangtang, Aba 3241N Alt. 3379m1.2 方法方法 1.2.1 羌活基因组总羌活基因组总 DNA 的提取的提取 采用改良 CTAB 法提取羌活基因组总 DNA 11。在研磨过程中加入适量 PVP，加入提取缓冲液（-CTAB）冰浴 10min，7000r/min ,4离心 10min，收集沉淀，加入提取液，65恒温水浴 30min，氯仿异戊醇溶液抽提两次，纯化过程加入 Rnase 37温浴 1h，加入 1/2 体积 4mol/L NaCl，获得的 DNA 溶于适量 0.1TE 缓冲液（10ng/L
10、） ，用 0.8的琼脂糖凝胶电泳（0.5TBE）检测总 DNA 大小和完整性，用 -Hind digest(TaKaRa)作为分子量标记，将样品浓度稀释至 310ng/L，4保存备用。 1.2.2 RAPD 扩增扩增 引物筛选出 15 个扩增良好、条带清晰、稳定性和重复性好且相对较多条带的引物（TaKaRa，宝生物工程（大连）有限公司）用于全部 DNA 样品的 RAPD 扩增（表 2） 。 http:/ - 3 - 表 2 引物序列及扩增结果 Table 2 Numbers and Sequence of 15 arbitrary primers 引物编号 Primer 引物序列 5-3 Pr
11、imer sequance(5-3) 条带总数 Total bands多态性条带数 Polymorphyic bands 多态性条带百分率(%) Percent of polymorphyic bands S22 TGCCGAGCTG 12 7 58.33 S24 AATCGGGCTG 7 4 57.14 S28 GTGACGTAGG 17 16 94.12 S29 GGGTAACGCC 12 9 75.00 S30 GTGATCGCAG 18 13 72.22 S31 CAATCGCCGT 13 8 61.54 S65 GATGACCGCC 14 8 57.14 S142 GGTGCGGGA
12、A 4 2 50.00 S193 GTCGTTCCTG 16 11 68.75 S406 CTGGGCAACT 16 11 68.75 S467 GTCCATGCCA 14 10 71.43 S502 CACAGCTGCC 14 8 57.14 S503 ACACAGAGGG 11 11 100.00 S1127 TCGCTGCGGA 10 5 50.00 C-04 CTCGCCGTCA 7 5 71.43 总计 Total 15 185 128 69.19 反应在 PTC-200 Thermocycler PCR 仪 （MJ Research 公司） 上进行， 重复一次。 RAPD-PCR反
13、应体系经比较和优化确定为： 20l 体系中含 310ng 模板 DNA，2.0l 10PCR buffer(无Mg2+)，2.0mmol/L MgCl2，0.15mmol/L dNTPs，引物 0.05mol/L，2U TaqDNA 聚合酶。扩增程序：94预变性 4min，94变性 45s，36退火 30s，72延伸 2min，循环 35 次，72最后延伸 5min，4保温，终止反应。扩增产物检测：PCR 扩增产物用 1.4的琼脂糖凝胶于 4V/cm 的电压下电泳，电泳缓冲液为 0.5TBE 或 1TAE，0.5ug/uL 溴化乙锭(EB)中染色30min，用 DL2000 和 Marker
14、（清华天为时代）作为标准分子量标记，在 Gene genius Bioimaging System 凝胶成像系统（SYNGENE）上拍照记录。 1.2.3 数据分析数据分析 用 DL2000 和 Marker 做分子量标记，对照反应产物在胶上的位置，电泳图谱的每 1条带记为 1 个位点，只记录可辨认、两次扩增结果一致的条带。用“1”和“0”记录同一位点的“有”和“无”，得到 0/1 矩阵输入计算机。 （1）居群遗传结构分析包括种内多态性水平的检测、个体间遗传关系的测度及居群间遗传分化程度的评价3 个方面。种内多态性水平的检测：通过统计RAPD 扩增产物的条带总数和多态性带数,计算各亚居群、居群
15、内及种内的多态性比率( PPB)，用POPGENE Version 1.32(Yeh et al，1997)12软件计算基于条带表型频率的Shannon 多样性指数（H，在物种水平上为Hsp，在居群水平上为Hpop）和基于Hardy-Weinherg 平衡假设的Nei(1972) 基因多样性指数(h) 来反映不同结构层次亚居群内的遗传多样性。个体间遗传关系分析：根据表征矩阵, 用SPSS13.0 软件计算各样品间的Jaccard 相似系数，然后使用Within groups linkage 进行聚类分析。居群间遗传分化程度考察：通过Popgen32软件计算得到Neis遗传分化系数（Gst（Ht-Hs）/Ht）和基因流（Nm=(1-Gst)/2Gst） ，计算Shannon居群分化系数（ （Hsp-Hpop）/Hsp）来估测居群间的遗传变异；同时运用AMOVAprep 1.01(Mark P. Miller.1998)13对RAPDhttp:/ - 4 - 表型数据矩阵进行计算，得到表型间的距离系数，组成WINAMOVA所需要的距离系数（2）矩阵文件，即距离文件（.dis） ，用WINAMOVA155（Excoffier,1993）14 进行分子方差分析(AMOVA)，计算居群内、
