血浆心钠素(anf)放免分析试剂盒的研制

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1、第10卷 第3期1997年8月同 位 素Journal of IsotopesVol . 10 No. 3A ug. 1997血浆心钠素(ANF)放免分析试剂盒的研制苏静贤 侯惠仁(中国原子能科学研究院同位素研究所,北京102413)采用氯胺T(Ch2T)法对人心钠素( 2hAN F,以下简称AN F)进行125I标记,用Sephadex G50柱分离纯化,得到比活度 10 MBq? g、 放化纯度 90%、 与过量抗体结合率为(7881)%的125I2AN F。建立了稳定的冻干系列标准及简便、 快速的分析方法。试剂盒的标准曲线范围为653 250pmol?L ,在曲线范围内测定人血浆的平均回

2、收率为(9314115)% ,高值血浆稀释相关系数r=01999 201999 8,灵敏度为17 pmol?L ,批内变异系数为(312415)% ,批间变异系数为(311612)% ,非特异结合率为(119415)%。健康人血浆的AN F含量正常值为122102418 pmol?L(xs,n= 97)。关键词 心钠素(AN F) 放免分析 试剂盒心钠素(Cardinatrin)亦称心房利钠因素(A trialN atriuretic Factor,简称AN F)。 2hAN F 由28个氨基酸组成,相对分子量为3 080. 5。 它主要分布在心脏,也广泛分布在人体的肺、 肾上 腺等多种器官中

3、13。1984年以来,心钠素在人体内的分布、 释放、 代谢、 受体功能和调节等方 面研究及测试方法研究取得很大进展3, 4,特别是用放免分析测定人血浆中的AN F含量,为 临床心血管疾病研究和治疗监测提供了有效依据1, 5, 6。目前,AN F放免分析方法有平衡法和非平衡法两种5, 6。本文拟建立平衡分析法,对标记物、 标准品、 抗血清的介质、反应温度、 反应 时间和反应体系进行条件试验,旨在研制出快速、 灵敏、 操作简单、 准确测定人血浆中AN F含 量的试剂盒。1 实验材料111 主要试剂 碘化钠(N a125I)溶液:放化浓度为317714MBq?mL , pH8- 10,中国原子能科学

4、研究院 产; hAN F原料:人工合成,相对分子量3 08015,色谱纯(98% ), SIGMA公司产品;第二抗体: 滴度14110,中国原子能科学研究院产;兔抗AN F血清:亲和常数K= 1109Lmol- 1,工作滴度15104;表面活性剂X2100, Sephadex G50,抑肽酶(1104U?mL),聚乙二醇(相对分子量为6 000)等均为国产或进口分装。112 主要仪器Ratemeter P7973放射性纸色层扫描仪(英国PANAX公司), L KB 1260M ultigamma 11收稿日期: 1996208222 修改稿收到日期: 1997201210放射性 计数器(芬兰W

5、ALLAC公司),LD5210离心机(北京医用离心机厂), STEPPER 411 分装器(瑞士),放射性电离室(中国原子能科学研究院)。2 实验方法2. 1 125I-ANF的制备AN F、Ch2T、N a2S2O5均用012mol?L pH7. 4磷酸盐缓冲液(简称PBS)溶解。取一小玻璃 瓶,加入AN F溶液10L(内含AN F 5g)、N a125I 92. 5MBq和PBS 100L混匀;再加入Ch2T溶液30L(内含Ch2T 20g),反应5 m in,然后加入N a2S2O5溶液30L(内含N a2S2O5300g)中止反应。标记后的混合液取5L点于W hatman 1号层析纸,

6、其余溶液移入Sephadex G50柱进行纯化,用015mol?L HA c淋洗。标记液纸层析扫描谱示于图1,淋洗曲线 示于图2。根据标记率和投料量计算125I2AN F比活度。图1 125I2AN F标记液纸层析扫描谱图2 125I2AN F淋洗曲线212 ANF标准品的制备 用0105 mol?L pH714 PBS(019%生理盐水配制,内含抑肽酶1105U?L、 表面活性剂X2100 110 mL?L、 牛血清白蛋白1 g?L、N aN3015 g?L)将AN F配制成130、325、650、1 300、3250、6 500 pmol?L的标准品溶液,以每瓶015 mL分装冻干, 4存

7、放。213 抗血清工作液制备 兔 抗AN F血清用0105 mol?L pH7. 4 PBS溶液(内含牛血清白蛋白1 g?L、N aN30. 5 g?L、 少量伊文思兰)稀释并作试验,取B0?T为35%50%相应浓度的抗血清配成工作 液, 4存放。2. 4 试剂盒组成 由系列标准品、125I2AN F、 抗血清、 温育液(0105 mol?L pH7. 4 PBS溶液(内含抑肽酶1105U?L、 表面活性剂X2100 110 mL?L、 牛血清白蛋白1 g?L、N aN30. 5 g?L)、 抗凝剂、 分离 剂以及说明书组成。215 操作方法按说明书配制,表1程序操作。4反应1724 h后,加

8、入分离剂,混匀后以3 000g离 心15 m in,弃上清液,测沉淀放射性计数率。141 第3期 苏静贤等:血浆心钠素(AN F)放免分析试剂盒的研制表1 ANF放免分析程序L 试 管总T管试剂NSB管血样NSB管零标准管标准管样品管温育液200100100标准品100样 品1001)100125I2ANF100100100100100100抗ANF血清100100100注: 1)任意血浆3 结 果311 125I-ANF质量鉴定 统计1994、1995两年20批125I2AN F制品,其比活度为7141419MBq? g,放化纯度为(9096)% ,与过量抗体(10倍于使用抗体浓度)结合率为

9、(7881)% ,非特异结合率为(119415)% ,零管结合率为(38155511)%。125I2AN F冻干品经37考验2周,然后于4存放,测定其存放期间的N SB、B0?T,计算 取代比,以观察125I2AN F的稳定性。结果列于表2。表2 125I-ANF的冻干品37考验2周的实验结果4存放时间?dNSB?%B0 T?%取代比1)1772)3. 20. 455. 14. 27. 50. 3334. 20. 244. 72. 39. 70. 2632. 70. 238. 91. 69. 30. 4注: 1)零标准管结合率与最大标准管结合率之比; 2)冻干后直接于4存放312 标准品稳定性

10、 冻干系列标准品在4存放12周及37存放2周的实验结果比较列于表3。表3 冻干系列标准品稳定性比较存放条件标准品浓度?pmolL- 165162153256501 6503 250412周的BB0?%871173145911441920151311372周的BB0?%861071196213431321141210313 抗血清稳定性 取- 20条件存放的抗血清冻干品溶解,溶解后的液态抗血清分别于室温、37存放2 周,做试验后再于4存放。测定其存放不同时间的零管结合率,与直接从- 20取出冻干品241同 位 素 第10卷 溶解的结果比较,结果列于表4。表4 液态抗血清稳定性存 放 条 件4存放

11、时间?dB0 T?%冻干品, - 2027050. 8液态、 室温2周后4120(210)1)50. 8?(51. 0)液态、372周后4120(210)5111?(5111)液态、4120(210)4811?(5116)注: 1)括号内数据为对应条件下不同存放天数及其相应的B0 T值314 ANF标准抑制曲线以各标准管的B0?T为纵座标,标准品浓度的对数值为横座标作图,得到AN F标准抑制图3 AN F标准抑制曲线曲线(图3)。315 方法学鉴定 按测定零标准均值减2倍标准差的方法计算 本试剂盒的灵敏度为17 pmol?L ,回收率为9314%115% ,批内CV为312%415% ,批间C

12、V为311%612% ,N SB为119%415%。取 一血样,加入一定量的标准AN F,然后对样品进 行稀释试验,在曲线范围内其稀释倍数和AN F 测定值的相关系数为01999 201999 8,关系式为y= - 74+ 3 493x(x为稀释倍数,y为AN F浓 度(pmolL- 1)。316 正常参考值 通过医院97例健康人(年龄在2259岁)血 浆样品分析,正常参考值xs= 122. 02418pmol?L ,且性别之间无明显差异。317 试剂盒的稳定性 试剂盒全部组分分别置于冰箱(28)、 室 温(2025)、37恒温箱条件下存放,不同存 放条件的分析结果列于表5。表5 ANF试剂盒

13、稳定性存放条件NSB?%B0 T?%ED?pmolL- 1ED20ED50ED80冰箱(13周)31001841182171 628161061046219291912111814 室温(2周)31201741151191 60711741645618201911915616 室温(3周)31401738191131 6721456184691716151231251237(2周)41101438141151 66019741847211181412315610341 第3期 苏静贤等:血浆心钠素(AN F)放免分析试剂盒的研制4 讨 论(1)人的心钠素有 、 、 三种,都具有生物活性,其中以

14、 活性最强,但生理半衰期只有215 m in。 心钠素分子中第105和121位有两个半胱氨酸,经一个二硫链组成一环状结构,这是维持其生物活性所必须的。在125I2AN F制备、 标准品和试剂盒分析方法研究时都要从保持 2AN F的活性着手。试验证实,制备125I2AN F时,采用Ch2T法,取可以标记范围的氧化剂量最 少、 反应时间最短、 标记纯化以HA c溶液作淋洗剂为最佳;液态标记物尽快冷冻干燥能保持标 记物的高活性。系列标准中加入抑肽酶或苯甲脒抑制剂,能延缓 2AN F的降解。(2)参照卫生部对试剂盒质量要求的可测限、 可测范围、 特异性、 正确性、 稳定性、 精密性等指标内容作评价,或

15、以Cerceo效点系统打分法打分,本心钠素试剂盒都属较优水平。试剂盒 在37考验两周后于4存放的试验结果说明,经过自然温度运输后到达用户手中,试剂盒 仍稳定有效。(3)正常人血浆中 2AN F参考值数据,因采用的试剂盒分析方法不同而各异,非平衡法所得正常值较平衡法低57。同时在加入分离剂后,测量的数值与室温放置的时间长短有关。本文中的正常参考值是采用平衡法分析的结果。参 考 文 献 1 汤 健,谢翠微编著 1 心钠素 1 北京:北京医科大学,中国协和医科大学联合出版社, 1989136421 2 A ckermann U. Structure and Function of AN F. Cli

16、n Chem, 1986, 32: 241. 3 N eedleman P. A triopeptin Biochem ical Pharmacology.Fed Proc, 1986, 45: 2096. 4 Tang J, Fei H, Xie CW , et al . Characterization andLocalization ofA triopeptin in RatA trium. Peptides, 1984, 5: 1173. 5 TakcshiN , Haruhiko S, Yasuhiro Y, et al . Radioi mmunoassayofA trialN atriure