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1、Vol. 32 No. 6 Jun. 2012第 32 卷 第 6 期 2012 年 6 月 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报Journal of Central South University of Forestry 2. Institute of Biological and Environmental Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)Abstract: An effective cellulase-p
2、roducing fungus named B-5 was isolated from the primary forest soil in different regions of the protected area in Shennongjia, Hubei, China, by using the methods of CMC-Na culture medium, Congo red staining, disintegration of filter paper and measurement of enzymatic activity of cellulose. The strai
3、n was identified as Fusarium by observing its colony morphology and microscopic characteristics as well as ITS sequence homology analysis, having the similarity of 99% with Fusarium equiseti. The filter disintegration experiments show that the fungus had strong capacity of filter decomposition in wi
4、thin 72 hours and the weight loss rate reached 37.9%. By taking CMC-Na as the carbon source, peptone as nitrogen source, 28 , 180 r/min, cultured 5 days, the initial activity were FPAase of 2.09 IU/mL, CMCase of 5.20 IU/mL. After optimization of fermentation conditions, by taking rice straw as the s
5、ole carbon source, initial pH of 6.1, 1.0%, nitrogen concentration 0.1%, carbon concentration 2.5%, rhamnolipid addition 0.1%, the FPAase reached 2.205 IU/mL, the corresponding CMCase was 5.174 IU/mL. Key words: cellulase; fungus; screening and identification; optimum of fermentation condition维素酶活力不
6、高是限制木质纤维资源利用的主要因素3， 所以选育高产纤维素酶的菌种是关键所在。产纤维素酶的生物种群十分广泛，如细菌、真菌、放线菌及昆虫、软体动物和原生动物等，而目前主要是利用细菌、真菌和放线菌等微生物发酵来获得纤维素酶4。细菌类包括纤维黏菌属、纤维杆菌属和芽孢杆菌属等；放线菌包括链霉属、高温放线菌属和弯曲热单胞菌等；真菌类包括木霉119第 32 卷中 南 林 业 科 技 大 学 学 报定酶活（FPA 酶活、CMC 酶活）大小。 1.2.3 酶活测定8FPA 酶活：取四支试管，将裁剪成 500.5 mg 滤纸条折成 M 形沿竖直方向推到试管底部，加入 0.05 mol pH4.8 柠檬酸缓冲液
7、1.5 mL，待测酶液0.5 mL（空白管不加），充分混匀后于 50水浴放置 60 min，迅速向各管加入 DNS 试剂 3 mL，空白管加酶液 0.5 mL，沸水浴放置 10 min，冷却后定容至 25 mL，用空白管调零，540 nm 测定 OD值，以吸光度平均值查标准曲线计算还原糖含量。CMC 酶活：取 4 支试管，分别加入用 0.05 mol pH4.8 柠 檬 酸 缓 冲 液 配 置 的 CMC-Na 液 2 mL，待测酶液 0.5 mL（空白管不加），充分混匀后于 50水浴放置 30 min，迅速向各管加入 DNS试剂 3 mL，空白管加酶液 0.5 mL，沸水浴放置 10 min
8、，冷却后定容至 25 mL，用空白管调零，540 nm 测定 OD 值，以吸光度平均值查标准曲线计算还原糖含量。上述酶活测定，反应后均用 DNS 法测定酶解产生的还原糖量，酶活单位采用国际单位，1 mL酶液 1 min 分解底物生成 1 mol 葡萄糖的酶量定义为 1 个酶活单位，以 IU/mL 表示。 1.2.4 形态鉴定将菌株接种到 PDA 平板上，培养 3 天，观察菌落的特征。 在平板上挑菌体少许， 涂于载玻片上，乳酸石碳酸棉兰染色液染色后置于显微镜下观察（水浸片法），参照真菌鉴定手册9进行菌种鉴定。 1.2.5 18SrDNA 序列鉴定 100 mg 菌丝样品于液氮中研磨至粉末，保存于
9、 1 mL 离心管中10。利用酵母总 DNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取菌株总 DNA，采 用 ITS1 （5-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3） 和 ITS4（5-TCCT CGCC TTAT TGAT ATGC-3）引物扩增菌株 18SrDNA 转录间隔区11。PCR反应体系为 50 L，程序为：94预变性 5 min，94变性 50 s，51退火 50 s，72延伸 2 min，30 个循环，最后 72延伸 10 min。扩增产物经琼脂糖电泳检测后送北京六合华大基因公司测序，于 NCBI 数据库 Blast 比对分析。 1.2.6 产酶条件的优化 首先进行产
10、酶培养基单因素试验，保持培养基中其他成分不变，分别改变其中的碳源、氮源、初始 pH 和表面活性剂（鼠李糖脂）12这 4 个因素，筛选出影响 B-5 菌株产纤维素酶的最佳单因素。然后设计 4 因素 3 水平正交试验13，确定产纤维属、曲霉属、青霉属、漆斑霉属、孢霉属等5。本研究从自然界筛选得到一株高产纤维素酶的真菌，经鉴定为镰刀菌属，拓宽了产纤维素酶的真菌属种，为木质纤维的降解提供了参考。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 样品 采集地点为湖北省神农架保护区，具体采样地点包括大龙潭、鸭子口、板壁岩等地，样品均为森林腐质土壤。稻草粉，收集长沙县脱谷稻草秸秆，剪成 3 cm 片段，烘干后用微型
11、植物粉碎机粉碎至 30 120 目。 1.1.2 培养基 CMC-Na 培养基：CMC-Na 15 g，NH4NO3 1 g, 酵母膏 1 g，MgSO47H2O 0.5 g，KH2PO4 1 g，去离子 H2O 1 000 mL，琼脂 2%，pH 自然。刚果红纤维素鉴定培养基：(NH4)2SO4 0.2%，MgSO47H2O 0.05%，K2HPO4 0.1 %，NaCl 0.05%，CMC-Na 2.0%g，刚果红 0.02%，琼脂 2.0%，pH 自然。滤纸液体培养基：滤纸 2 g，NH4NO3 1 g，酵母膏 1 g，MgSO47H2O 0.5 g，KH2PO4 1 g，去离子H2O
12、250 ml。 液体产酶鉴定培养基6：蛋白胨3 g，酵母膏 0.2 g，(NH4)2SO4 2 g，KH2PO4 4 g，CaCl22H2O 0.3 g，MgSO47H2O 0.3 g，CMC-Na 10 g，去离子 H2O 1 000 mL，pH 自然。种子培养基：葡萄糖 20 g/L，蛋白胨 1 g/L，Mandels 营养盐浓缩液 100 ml/L，Mandels 微量元素浓缩液 1 ml/L，1 mol 柠檬酸缓冲液 50 ml/L。1.2 分析方法1.2.1 初筛方法 利用 CMC-Na 培养基获得纯菌落，用 1 mg/mL 的刚果红溶液染色 30 min7，再用蒸馏水清洗，最后用
13、1 mol/L 的 NaCl 溶液脱色 30 min。以透明圈的直径和菌落直径的比值大小作为筛选的标准，将筛选到的菌株接种到滤纸液体培养基中，28，180 r/min，以不接种任何菌株的滤纸液体培养基作为空白对照，重复 3 次实验，以滤纸的失重率 (X) 作为筛选的标准，X=(m-m1)/m，其中 m为最初滤纸质量， m1降解后滤纸经烘干后的质量。 1.2.2 复筛方法 将初筛得到的几株菌按 5% 的接种量接种到液体产酶培养基中， 28， 180 r/min， 振荡培养5天后，将培养液 4 000 r/min 离心 10 min，取其上清液测陆 晨，等：一株产纤维素酶真菌的筛选及产酶条件优化1
14、20第 6 期素酶的最优组合。2 结果与分析2.1 初筛结果 利用 CMC-Na 培养基分离得到 9 株形态不同菌种，有细菌、放线菌和真菌。刚果红染色，均产生大小不一水解圈，其中 B-5 菌株水解圈直径与菌落直径比值并不是最大，见图 1。将分离得到9 株菌接种到滤纸液体培养基培养 3d 后，测定滤纸失重率，其中接种 B-5 的培养基中滤纸条被崩解成不规则小片，整个培养基成糊状，见图 2，滤纸失重率为最大，达 37.9%。表1 各菌株酶活大小 Table 1 Cellulase activity of each strain IU/mL菌株A-1A-2A-3A-4B-1B-2B-3B-4B-5F
15、Pase1.330.890.561.140.610.731.061.152.09CMCase3.841.560.782.450.591.062.141.185.202.3 形态鉴定PDA 培养基 28条件下培养 4 天后菌落直径达到 3 cm 左右，菌落起初呈粉白色，4保藏 10天后局部呈淡黄色，见图 3。菌落表面附着孢子，绒毛状。显微镜下观察，菌丝缠绕抱团，由单细胞链接而成，见图 4。通过菌落和菌丝特征，推测其为一株真菌。2.2 复筛结果 对于以上 9 株菌均进行了产酶实验，它们的FPA 酶活和 CMC 酶活见表 1，可见 B-5 的 FPA 酶活和 CMC 酶活均最高。图 1 B-5 菌株
16、刚果红染色结果 Fig.1 Congo red staining of B-5图 2 B-5 菌株滤纸崩解结果Fig.2 Results of filter paper disintegrating by B-5图 3 B-5 菌株 PDA 培养基生长情况 Fig.3 Growth of B-5 in PDA图 4 B-5 菌株菌丝情况 Fig.4 Microscopic examination of B-5s hyphae2.4 分子鉴定获得 B-5 菌总 DNA 模板后，利用 ITS 引物在4 个退火温度梯度下（51、53、55、57）进行 PCR 反应，均得到目的扩增产物，大小 700 bp 左右，见图 5。测序拼接后登陆 Genebank 进行Blast 比对
