《骨髓基质干细胞向神经细胞诱导分化及体内移植治疗脑缺血的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《骨髓基质干细胞向神经细胞诱导分化及体内移植治疗脑缺血的实验研究（70页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、骨髓基质千细胞向神经细胞诱导分化及 体内移植治疗脑缺血的实验研究目的神经干细胞的发现及其分离鉴定、培养技术的建立，使神经细胞不可再生的传统理论面临巨大挑战，并为神经系统疾病的治疗提供了新的思路。但神经干细胞数量少、分布分散，体外培养时取材困难，无免疫原性神经干细胞系建立困难，以及异体移植的种属差异和社会学、伦理学等方面的问题都极大地限制了神经于细胞的应用。成体动物的骨髓中存在一定数量的骨髓基质干细胞( M S c s ) ，骨髓基质干细胞在适当条件下可以向神经干细胞、神经元、和神经胶质细胞方向分化。M s C s 诱导分化为神经元样细胞的研究工作已有一定突破，但诱导形成的神经元样细胞存在着存活
2、时间不长，2 4小时后大多死亡的问题。故如何延长M S c s 源性的神经元样细胞的寿命是极为重要的。另一方面M S C s 移植治疗缺血性脑损伤虽己取得一定的进展，但M S c s 移植后在体内环境下分化为神经胶质细胞的比率较大而分化为神经细胞的比率较小，所以如将骨髓基质干细胞在体外分化为神经元样细胞，再行细胞移植将会有事半功倍的效果。本实验应用体外细胞培养技术将大鼠骨髓基质干细胞分离培养和纯化，测定M S C s 的细胞活力、生长曲线和贴壁率，用形态学方法鉴定培养的骨髓基质干细胞。将培养成功的骨髓基质干细胞在体外传代、扩增，以得到一定数量的细胞。以褪黑素( M T ) 和碱性成纤维细胞生长
3、因子( b H 灌) 予以干预，以期延长诱导的神经元样细胞的存活时间，并应用生存时间较长的M S c s 源性神经元样细胞，对局灶性脑缺血大鼠模型( M c A O ) 进行细胞移植。观察植入细胞的分布及存活情况，并探讨细胞植入后对M C A O 大鼠脑神经元c m y c 、E r k 蛋白及其m R N A 表达的影响。材料和方法( 一) 大鼠骨髓基质千细胞的分离培养、扩增纯化l - 大鼠骨髓基质干细胞的分离：应用贴壁法结合密度离心法分离大鼠骨髓基质干细胞。2 大鼠骨髓基质干细胞的扩增纯化：建立大鼠骨髓基质干细胞扩增纯化体系，为实验提供种子细胞。3 台盼蓝染色测定细胞活力。4 骨髓基质细胞
4、贴壁率检测。5 骨髓基质干细胞的鉴定：应用免疫荧光法鉴定培养细胞的体表标记，c D 4 5 、c D 9 0 。应用免疫细胞化学法鉴定培养细胞的体表标记，c D 3 4 、C D 4 J 4 。( 二) 大鼠骨髓基质于细胞向神经细胞诱导分化的研究1 M S C s 的培养和纯化。2 ，M S C s 向神经细胞的定向诱导分化：应用M T 、b F G F 诱导体外培养的大鼠骨髓基质千细胞向神经细胞分化。3 诱导细胞的免疫荧光法鉴定：免疫荧光法鉴定分化细胞N S E 、G F A P的表达。( 三) 大鼠骨髓基质干细胞分化后移植、治疗局灶性脑缺血大鼠的实验研究1 大鼠骨髓基质干细胞的分离培养、扩
5、增。2 体外M S C s 向神经元样细胞诱导分化，分化后细胞在体外以B r d u 进行标记。3 大鼠脑局灶性缺血模型( M C A 0 ) 的制作及神经功能评分。4 大鼠M S C s 源神经元样细胞经颈动脉注入M c A O 模型。5 B r d u 标记细胞的免疫组化染色：观察植入细胞的成活率。6 免疫组化染色法测定大鼠脑内c m y c 、E r k ，原位杂交法测定c m y c 、E r kI n R N A 。观察细胞植入对上述指标的影响。2 结果( 一) 大鼠骨髓基质干细胞的分离培养、扩增纯化1 接种l 周后细胞集落迅速增多，随着集落不断扩大，互相融合，1 0 1 2 天细胞
6、贴满培养瓶底，细胞以梭形和园形为主。2 传代培养后的细胞不再以成集落方式生长，生长速度比原代要快。3 P 1 、P 3 、P 5 代M s C s 三代细胞在各时间点的贴壁率无显著性差异。4 传代大鼠M s c s 潜伏期为1 2 天，从第3 天起细胞大量增殖进入对数生长期，第6 天达到高峰期，以后进入平台期。 5 M S C s 表达C D 9 0 、C D 4 4 丽不表达造血细胞的表面标志C D 3 4 、C D 4 5 。( 二) 大鼠骨髓基质干细胞向神经细胞诱导分化的研究1 加入含M T 、b F G F 的培养液后，3 天后见部分细胞胞体收缩，折光性增强，伸出突起，部分细胞胞体收缩
7、成三角形，并有些成为简单的双极细胞或多极细胞。2 诱导7 2 小时细胞开始表达N S E ，9 一1 4 天阳性细胞增多，以M T +b F G F 组变化显著，而不表达G F A P 。3 诱导分化前E r k 蛋白在M S c s 胞浆中只有微弱的表达，而在诱导的3天后E r k 阳性细胞大量出现。( 三) 大鼠骨髓基质干细胞分化后移植、治疗局灶性脑缺血大鼠的实验研究1 M C A O 大鼠细胞植入后神经功能评分较对照组明显改善。2 细胞植入组大鼠脑内4 8 小时在损伤侧脑中见散在B r d U 阳性细胞，7 天后B r d U 阳性细胞逐渐增多，1 4 天时阳性细胞数不再增多。3 M C
8、 A 0 大鼠在细胞植入4 8 小时内，在基底节、皮层、海马区神经细胞均可见C m y cm R N A 阳性细胞。4 M C A 0 大鼠脑中E r k 蛋白、E r km R N A 阳性细胞在细胞植入2 4 4 8 小时增多。l 周后E r k 蛋白阳性细胞仍保持在较高比例。结论1 密度梯度离心法与贴壁培养法相结合是分离骨髓基质干细胞简便3 高效的方法，大量扩增M S C 8 是可能的。M s c s 表面表达c D 9 0 、C D 4 4 ，且阳性率较高。2 M T 和b F G F 诱导之神经元样细胞大部分能存活1 4 天并可稳定表达神经元的特异性标记N S E 。M T 、b F
9、 G F 激活E r k 信号传导通路可能是M s c s定向诱导分化的机制之一。3 经颈动脉途径植入神经元样细胞明显改善了M C A 0 大鼠的神经功能。细胞植入可能通过下调c m y c 水平达到抑制神经元的凋亡；激活E r k 信号传导通路促进损伤后神经细胞的修复和再生。关键词骨髓基质干细胞；褪黑素；碱性成纤维细胞生长因子；大脑中动脉闭塞；细胞外信号调节蛋白激酶；5 一溴一2 脱氧尿苷；神经元特异性烯醇化酶；胶质纤维酸性蛋白；表面抗原决定簇9 0 ；表面抗原决定簇4 5 ；D M E M培养基；丝裂原激活蛋白激酶d E 印e r i m e n t sa n dr e s e a r c
10、 h e so ni n d u c e dd i f f e r e n t i a t i o no fr a tm e d u as t r o m a ls t e mc e U st o w a r d sn e u r a Ic e U sa n da p p l i c a t i o no fc e Ht r a n s p l a I I t a t i o ni n仃e a t m e n to ff b c a Ic e r e b r a li s c h e 武ao b j e c t i v eT h ed i s c o V e r yo fn e u r a l
11、s t e mc e U sa I l dt l I ee s t a b U s h m e n to ft h ei s o l a t i o n ，i -d e n t 试c a t i o na n dc u l t u r et e c 量l I l o l o 西e sf o rt h e mn o to l l l yg i v eag r e a tc h a l l e n g et ot 1 1 e 妇d i t i 仰a 1 出e o r yt h a tn e m lc e l l sc o u l d n tb er e g e n e r 8 t e d ，b u
12、 fa l s oo p e nu pan e ww a yf o rt h et r e a t m e mo f t l l ed i s e a s e so f t l l en e r v o u s8 y s t e m B u t 也eu g eo fn e u I ms t e mc e U si ss e v e r e l y1 i m i t e db ys o m ef a c t o 碍，i n c l u d i n gm el i t t l e 砌o u n ta n dd i s p e r s e dd i s t r i b u t i o no fn e
13、 u 工越s t e mc e U s ，t 1 1 e 蛐c u l t i e 8i no b t a i n i n gm a t e -r i a l sf o rc 讧h u r ei nv i Da n ds e t t i n gu pm ei m m u n o g e 由c i t y 一丘e en e l l r a ls t e mc e us y s t e m ，m ed i e r e n c eo fc a t e g o r i e si nc r o s st 脚I s p l a I l t a t i o n ，a n ds o c i o l o 舀c
14、a la n de t l i c a lp r o b l e m s W i t hm ei n t e n s 正e a t i o no ft 1 1 er e 8 e a r c h e sc o n c e m e d ，s t e mc e n su s e df o f 呦s 津鞠t a l i o nc 8 n wb eo b 垃n e df r o mm a n ys 蚴s 弧e r e 黜s o m em e d u n as t r o m a ls t e mc e U s ( M S C s ) i n 山em e d u ao fa d u l ta n i m
15、a l s R e -c e n ti n f b r I n a t i o ns h o w st l l a tm ed i 宅r e n t i a t i o no fH l e d L d l as t r o m a ls t e mc e U st o w a r d sn e u r a ls t e mc e U s ，n e u r o n sa n dn e u m 幽ac a nb er e a l i z e du n d e ra p p r o p r i a t ec o n d i t i o n s S o m eb r e a k m r o u g h
16、 sh a v eb e e na c h i e v e di nt h ei n d u c e dd i 饪色r e n -t i a t i o no f 】S C st on e u I o n h k ec e s b u tt h e s ei n d u c e dn e u r o n l i k ec e U sc a n n o ts u w i v el o n g ，m o s to fm e mw i Ud i ei n2 4h o u r s S oi t 奄e x t r e m e l yi m p o r t a n th o w op r 0 1 D n 只t 1 1 e1 如o fM S C s b o mn e 彻一l i k ec e H s S D m e 丑c h i e v e m 即t sh a v eb e e nm a d ei nt h et r e a t r n e n to fi
