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1、应用注释Ion外显子组测序采用ION PROTON系统和ION AMPLISEQTM技术的快速外显子组测序 配备AmpliSeq外显子组试剂盒的Ion Proton系统能够最大限度地降低成本和外显子组测序的复杂性， 在两天内即可实现约294,000个扩增子的富集和测序 AmpliSeq技术的力量能够在10覆盖度时提供94%高均匀度的碱基命中靶标率， 甚至每个Ion PI v2芯片可达两个外显子组 简单生物信息学采用Torrent Suite软件的点击式(point-and-click)运行设置和数据分析结合Ion Reporter软件的外显子组特定工作流程， 能够通过三人组分析完成高置信度的功
2、能缺失变异体的鉴定外显子组测序揭示重要的遗传变异虽然全基因组测序(WGS)有望彻底改变医学研究和人类的卫生保健，但数据分析的障碍加上WGS的费用仍促成外显子组测序的发展和成功运用。外显子组测序通过靶向所有基因组编码区的富集策略而询问可解释的部分基因组。外显子组测序有效地发现了WGS广度之间的中间地带，出于其数据分析的限制及符合成本效益的需要，因而与WGS相比，所需原始测序数据估计有10至20倍的降低1, 2 。对于遗传研究人员而言，外显子组测序能够识别负责孟德尔疾病以及能够解释复杂疾病遗传性的罕见原发性突变的单核苷酸变异体(SNVs)和小插入或缺失(indels)3。外显子组测序已经被证明是一
3、项强大的发现工具，能够揭示一些发育障碍、神经系统疾病、代谢性疾病、遗传性视力减退、血液和淋巴系统缺陷的致病突变。此外，外显子组测序还对癌症的遗传基础提出了基本观点。大规模多重扩增子测序的力量当试图发现已知和未知病因的疾病已知和罕见的变异体时，Ion Torrent提供了从全基因组至靶向基因组的连续全基因组测序解决方案。这种灵活性的基础是Ion AmpliSeq技术，这是一种大规模的多重PCR扩增方法，该法可采用免费的分析设计工具Ion AmpliSeq设计师进行定制，用于创建引物库，以靶向人类基因组内任意感兴趣的区域。此外，有各种现成可用的检测板，如Ion AmpliSeq癌症热点检测板v2和
4、Ion AmpliSeq综合癌症检测板(CCP)，这些检测板可分别用于50及400个癌基因和抑癌基因的靶向测序。对于更集中的测序成果，可用Ion AmpliSeq Community检测板，包括Ion AmpliSeq BRCA1和BRCA2检测板和由OncoNetwork联盟设计和验证的Ion AmpliSeq结肠癌和肺癌检测板，这种检测板靶向涉及结直肠癌和非小细胞肺癌的22个基因中的热点突变。图1. 具备易用性以支持实验室所有能力的综合外显子组测序工作流程。A)快速两日(6小时，构建文库；9小时，制备模板；3小时，运行序列；7小时，主要数据分析)外显子组测序工作流程，具备每次运行1至3个外
5、显子组的灵活通量，其数据分析方案能够提供相关的变异体而无需专用的生物信息学基础设施。B)由AmpliSeq技术所驱动，基于PCR富集的简单性导致最快速的总文库构建时间、无样本转移的较少手工操作时间和更简便的移液步骤Ion AmpliSeq 外显子组面板Ion AmpliSeq 文库试剂盒Ion OneTouch 2系统和 Ion PI模板 OT2 200 试剂盒或 Ion Chef系统*Ion Proton测序仪和 Ion PI芯片以及 Ion PI测序200试剂盒Torrent Suite软件和 Ion Reporter软件构建文库选择靶点制备模板运行序列分析数据B. 外显子组富集时间自动操
6、作时间手工操作时间*从Illumina Nextera快速捕获外显子组数据表获得的值 *从Agilent科技公司HaloPlex外显子组数据表获得的值，而手工操作时间是从试验方案中估算得到的0Hours510152025303540Nextera 快速外显子组 捕获试剂盒*HaloPlex 外显子组试剂盒*Ion AmpliSeq 外显子组试剂盒100% 98% 96% 94% 92% 90% 88% 86% 84% 82% 80%A.123每个Ion PI芯片的样本数AmpliSeq外显子组的碱基覆盖比例100%98%96%94%92%90%88%86%B.123每个Ion PI芯片的样本数
7、AmpliSeq外显子组的碱基覆盖比例A.当前，Ion AmpliSeq技术已扩展到靶向人类外显子组以采用配备Ion PI芯片的Ion Proton系统和采用Ion Reporter软件的数据分析方法以创建易于实现的、具有成本效益的、灵活的外显子组测序工作流程(图1A)。PCR技术的简单性和速度允许以最快速的方法在总文库构建时间94%覆盖率的单次测序运行过程中通过多达三个条码样本的复用所实现的(图2A)。Ion AmpliSeq外显子组试剂盒表现了高比例的碱基命中靶标率(90%)，同时不论样本多重性如何都具有优良的均匀度(图2B)。此外，外显子组测序的工作流程充分利用了Ion AmpliSeq
8、文库试剂盒和允许用于自动化模板制备和芯片加载的Ion OneTouch 2系统和Ion Chef系统其易于使用的综合工作流程的自动化试验方案。外显子组测序结果已经过“千人基因组项目”深度测序的Hap-Map CEU样本NA1 2878 (儿童)、NA 12891 (父亲)和NA 12892 (母亲)，即欧洲血统三人组家庭的三个成员的基因组DNA被用于评估Ion Proton系统和Ion AmpliSeq外显子试剂盒的性能。复用Ion PI v2芯片的两个样本，样本经过质量过滤和修整后产生11.3-14.3 Gb的序列，每个采用TMAP比对工具与人类基因组对齐的样本均含有3220-4470万个读
9、取数，其中，89.20-90.1% (2900-4000万)为命中靶标的(表1A)。对于所有三个样本，其平均读长约为160 bp。图2. 外显子组测序数据显示了采用Ion AmpliSeq外显子组试剂盒靶向效率的一致性。A)每个Ion PI芯片复用1-2个样本在10时(深蓝色)产生94%的靶向碱基覆盖比例，而在20时(灰色)，产生88%的靶向碱基覆盖比例。B)请注意，提高复用三个样本对达到的靶向碱基百分比(灰色)或靶向均匀度(如深蓝色所示，碱基百分比 20%的平均深度)的影响不大，而当进行三人组分析时，在10时拥有92%的靶向碱基覆盖比例。此处提供的数据汇编自30次测序运行和54个外显子组的数
10、据集A.B. 450,000400,000350,000300,000250,000200,000150,000100,00050,000001001502002503003500100150200250300350100806040200读取深度读取深度AmpliSeq外显子组的 碱基覆盖比例AmpliSeq外显子组的 碱基覆盖比例图3. 外显子组捕获的数据显示了采用Ion AmpliSeq外显子组试剂盒的靶向覆盖度和靶向效率的优异均匀度。A.红线和绿线为同一Ion PI芯片两种不同样本的结果，表明了Ion AmpliSeq外显子组试剂盒出色的靶向效率，其在10和20时分别含有97.3-97
11、.4%及95.0-95.2%的外显子组碱基覆盖比例。这大大优于采用MiSeq仪测序的单一的Nextera快速捕获外显子组富集(参见http:/ 同样，当与快速捕获外显子组(蓝线)比较时，Ion AmpliSeq外显子组试剂盒(红线和绿线)在特定读取深度下覆盖的外显子组碱基的均匀度或数量均为优异的。请注意，在接近117覆盖度的平均深度时，命中靶标碱基的最高数目的明显峰值，这远好于Nextera快速捕获外显子组富集所出现的均匀度。采用Ion AmpliSeq技术的外显子 组覆盖度和重现性变异体发现的重要因素为覆盖度，即与参考碱基对齐的平均读取数。覆盖度通常转化为变异识别的置信度，随着覆盖度的增大，
12、假定变异体的置信度则有所提高。靶向效率可通过确定所有靶向碱基的覆盖度来进行评估。平均覆盖深度为84.3-117.0，其至少一次覆盖99.2-99.3%的碱基，而在20覆盖度时，则覆盖92%的碱基(表1B)。与液相杂交富集方法相比，基于PCR的Ion AmpliSeq外显子组试剂盒的简单性和特异性显著优于Nextera快速捕获外显子组试剂盒，其在20时，覆盖95%的外显子组碱基，相比而言，后者则覆盖85%的外显子组碱基(图3A)。如在接近117的平均覆盖深度时，命中靶标碱基最高数目的明显峰值所示，Ion AmpliSeq外显子组试剂盒出现了高度的覆盖均匀度，这远优于Nextera快速捕获外显子组
13、富集所出现的均匀度(图3B)。高度的覆盖均匀度对于外显子组测序而言是十分重要的，因为这可以减少测序量，并降低实现具有显著比例的靶向外显子组碱基(例如， 90%)的理想阈值(例如，20)所需的覆盖测序成本。对比整个外显子组靶向覆盖度一致性的散点图表明，采用Ion AmpliSeq外显子组试剂盒和Ion Proton系统产生的重制是强烈相关的(图4)。测序复制(图4A)表现出很强的相关性(0.95)，但独立的文库复制(图4B)也是强烈相关的(0. 92)。靶向外显子组的一致性对于外显子组测序的日常使用是至关重要的，而整个约294,000个扩增子的测序读取深度的相关性说明了用于富集外显子组的Ion
14、AmpliSeq技术的稳健性和重现性。NA12878中的差异分析和由 RefSeq-CDS注释所确定的常见区域 的平台对比为了评估Ion AmpliSeq外显子组测序数据检测SNVs的能力，对NA12878中预测的变异体与由“Complete Genomics”公司(CG)所公开发布的WGS数据集内识别的变异体进行了比较。平台间比较仅限于由Ion Am-pliSeq外显子组富集所靶向的RefSeq-CDS注释内的变异体。采用https:/ v3.6.2的Ion AmpliSeq外显子组富集和Ion Proton测序，共识别出总计20,228个SNVs (图1C)。Complete Genomi
15、cs测序在相同区域内识别出22,831 个SNVs。在Ion Proton检测的SNVs中，63%(12698个)为杂合SNVs，而37%(7,530个)为纯合SNVs，其转换/颠换(Ti/Tv)的比例为2.85，这处于人类外显子组所估计的取值范围(Ti/Tv比约为2.8-3.1)内。SNVs的杂合与纯合的比率为1.69，介于欧洲血统通常所观察到的基因组范围内(1.25-1.7)。在SNVs中有很大的重叠，其中17,692个或69.7%在两个平台之间是一致的(图5)。这导致了87.5%的灵敏度(通过Ion Proton) /AmpliSeq外显子组工作流程所检测的SNVs的%CG)和77.5%的特异性(关于CG识别所检测的Ion Proton)的%SNVs)，其位点与杂合的一致性分别为69.7%和99.3%(表1C)。在非共有Complete Genomics的SNVs中，Ion Proton识别了2,536个(10.0%)平台特异性的SNVs。在大型多态性基因或重复区域中不存在的SNVs过滤和在单拷贝和非同源区域中的SNVs过滤已经成功地证明，许多Ion Proton特定的SNVs有可能是真正的外显子组变异体4
