《骨髓基质干细胞向肝细胞的定向诱导分化及其机理的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《骨髓基质干细胞向肝细胞的定向诱导分化及其机理的实验研究（55页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、骨髓基质干细胞向肝细胞的定向诱导分化及其机理的实验研究中文摘要目的：目d 口认为治疗肝功能衰竭的有效方法是肝器官移植，但由于供肝缺乏和免疫排斥反应，制约了肝移植的应用。骨髓基质干细胞( B M S C s ) 具有易获得、自我复制 能力强、在特定的条件下可向各J I 生层来源的细胞分化的特点。将B M s C s 定向诱导分化成为肝细胞，进行细胞移植，以替代损伤的肝细胞，对肝病治疗有非常重要的临床价值。本实验探索和筛选诱导B M s c s 向肝细胞定向分化为的最佳条件、探索C a “在B M S C s 向肝细胞定向分化过程中的作用、以及体内移植对肝损伤的治疗作用，为临床上应用B M S C
2、 s 进行细胞移植治疗肝损伤提供实验依掘。方法：用全骨髓法从大鼠骨髓中分离B M S C s ，纯化和扩增B M S C s 。M T T 比色法筛选B M S C s 的生长曲线，选择最佳生长状态的B M S C s ，培养体系中分别加入肝细 胞提取液( G ，2 0 毗l ! m l 、5 蜊m 1 ) 、大鼠和人束源的B 神经生长因子1 3 N G F f r o mr a t ( 8 一N G F - r ，2 0 n g m l 、5 0 n g m i ) 、母一N G Ff r o mh u m a n ( 1 3 一N G F - h2 0 n m l 、5 0 n g m 1
3、 )和肝细胞生长因子H G F O 吮g m 1 ) 诱导B M S C s 向肝细胞分化，通过镜下观察分化细胞的形态、R T - P C R 法和免疫细胞化学染色法检测肝细胞的特异性标志物白蛋白( A L B ) 和a 一抗胰蛋白酶( A A T ) 、吲哚靛青绿0 C G ) 摄取实验鉴定肝样分化细胞。应用流式细胞技术分别检测B M S C s 和G 诱导分化细胞内游离f C a 2 + l i 。将B r d U 标记后的B M S C s 异体移植入慢性肝损伤和对照组的小鼠体内，免疫组织化学法检测B M S C s在肝内的迁移和分化，血清学指标观察B M S C s 移植后对慢性肝损伤
4、的治疗作用。结果；( 1 ) 全骨髓分离培养法是纯化、培养和扩增B M S C s 的简便有效方法；B M S C s标准生长曲线表明体外培养扩增第3 5 代的细胞具有较高的增魑活力。( 2 ) 添加 G ( 2 0 0 M m l ，5 唰m 1 ) ，B N G Ff r o mr a t ( 2 0 n g m l ，5 0 n g m 0 ，B N G Ff r o mh u m a n ( 2 0 n g m l ，5 0 n g , m 0 和H G F ( 5 0 , u g m 1 ) 诱导后，分化细胞逐渐趋短变圆呈圆形和卵圆形，厕形细胞可以摄取I C G ，呈现绿色。免疫细胞
5、化学染色显示分化细胞呈A A T 阳性表达：各诱导组分化细胞的A A T 表达显著性高于对照组( P 0 0 5 ) ，两种不同来源的6 一N G F 诱导效果无差异显著性( P 0 0 5 ) 。O ) R T - P C R结果显示四种诱导剂诱导2 1 d 后，分化细胞均表达A L Bm R N A 。( 4 ) G 诱导形成的肝样分化细胞中【c a ：+ l i 较对照组细胞锰蒋性升高( P 0 0 5 ) 。表1 3分化细胞A A T 的表达表示j 对照1 1 l 差异柯址善件，P 0 0 5 ) 。表2 2 免疫细胞化学A A T 表达结果表示与对照组芹异仃显并性( P 0 0 1
6、)1 63 讨论钙广泛分布于人体细胞内和体液中，c a “作为胞内信使“主动”参与一切外来信号调控细胞功能的信号传导过程。静息状态下，细胞内游离 C a 2 + 1 i 为细胞外的1 2 0 0 0 0 ；在激动状念下，细胞内 C a “1 i 蟹双向升高【l ”。许多病理或疾病现象的发尘都伴随着细胞内C a 2 + 浓度的异常升高，如脑缺血、癫痫、糖尿病等1 1 9 J 。研究表明细胞【C a 2 + 】i 浓度的变化毛要受以下3 个系统调控1 2 02 1 l ：( 1 ) 细胞膜外的钙跨膜内流，如 电压依赖性和受体依赖性钙通道，激活钙通道，日I C a “1 i 增) J l l ；(
7、2 ) 胞浆内钙贮存池释放，分布在肌浆f f x J ( S R ) 的R y a n o d i n e 敏感受体( R Y R ) ，I P 3 敏感受体( I P 3 R ) - J分别被R Y 和I P 3 激活，贮存池钙释放进入胞浆；( 3 ) 细胞核膜的I P 3 R 与l P 3 结合后，钙通道丌放，使贮存在核膜I 日J 隙内的钙释放入核浆及胞浆中。细胞内C a “约8 0 是通过细胞膜上的固有通道由细胞外进入的。有证掘表明细胞P b C a “内流，导致一种信号小分子物质的释放操纵钙池C a “排空1 12 1 。细胞内游离C a 2 + 浓度变化足多种受体激动信号传递过程的中
8、心环节。细胞内游离C a “不仅维持膜两侧的跨膜钙浓度梯度，介导细胞对外界刺激的应答反应，埘实现信息的跨膜传导，而且作为重要的第二信使参于细胞的增殖、分化、腺体的分泌、神经递质的释放等细胞的功能活动。为探讨细胞因子诱导B M S C s 在向肝细胞定向分化的机理，本实验检测了肝细胞提取液诱导B M S c s 在向肝细胞定向分化过程中细胞游离c a “的变化。本文采用第3 代荧光探针F l o u 3 A M 标记细胞内游离C a “。流式细胞检测仪检测C a “l i T Y 法，比较敏感可靠。F l o u 3 A M 是一种新型的、无细胞毒性的、胞膜通透性、可激发出可见光的敏感性钙指示剂
9、，能以甲酯形式特异性地与细胞内C a “结合，并在定波长激发光激发后产生荧光( 激发波长4 8 8 n m ，发射光波 圭6 2 0 n m ) ，荧光强度的变化可指示胞内游离钙浓度的变化。流式细胞仪可记录荧光强度的变化，检测到胞内 C a 2 + l i 的空问分布以及胞内 C a “1 i 的变化幅度1 2 3 J 。细胞内C a “通道的产生与其细胞增殖分化过程有密切关系。刚从机体分离出的细胞具备所有的C a “通道；在对数增殖期的细胞C a “通道可以一过性的缺乏。当体外培养的细胞增殖呈密集状态时，因接触抑制，细胞仅l P 3 R 通道保持非极化状念I2 4 1 。本实验通过用流式细胞
10、检测仪对诱导分化细胞和未诱导的B M S C s 对照组细胞进行检测，结果显示诱导分化形成的细胞的胞内 C a “l i 比对照组的细胞要高( P 0 0 5 ) 。提示【C a “l i 参与了肝细胞提取液诱导B M S C s 向肝细胞的定向分化过程。尼莫地平是作用广泛的特异性C + 通道阻断剂。本实验利用不同浓度的尼莫地平对诱导分化中的B M S C s 进行干预，结果表明加入尼莫地平干预后，诱导形成的肝样分化细胞明显减少，与对照组细胞相比有差异显著性( P O 0 1 ) 。加入较大剂量的( 5 0 t g m l 、1 0 0 Y g m 1 ) 尼莫地平干预后，不仅未见分化细胞，而
11、且B M S C s 的生长状青岛人学坝I 学啦论立=念差，可见细胞内 | 现颗粒、胞质收缩、碎裂，片状细胞脱落现象。提示仁l i 断C a “小仅阻断了B M S C s l ； 肝细胞定向分化过程，也影响了B M S C s 一常代谢过程。本实验结果衷l 仆】 C a “l i 参与了肝细胞提取液诱导B M S C s 向肝细胞的定向分化过程。细胞因子通过多种信号途径的发挥调常作用。钙调神经磷酸酶( c a l c i n e u r i n ，C a N )是一种受c a 2 + 及钙凋索( C a l c i n e u r i nM ，C a M ) 调节的多功能信号酶，通过使活化T
12、 细胞核因子( n u c l e a r f a c t o r o fa c t i v a t e d T c e l l s c ，N F A T c ) 转位入核，调节核内一系列基因的表达，在细胞通信过程中起重要作用1 2 5 l 。丝裂素活化蛋白激酶( m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ，M A P K ) 是细胞增殖与分化信号转导的共同通路，是细胞中多种信号向核内传递的共同途径，参与细胞多种的信号的转导。细胞外各种刺激信号通过不同的信息传递通路，共同交汇于蛋白激酶C ( P K C ) ，激活的P K C
13、 通过依赖或非依赖r a s 机制激活M A P K ，由此形成P K C M A P K 级联反应1 2 6 J 。有研究表明细胞的增贿效应被C a 2 + 通道阻断剂如尼卡地平、尼莫地平、P K C 阻断剂H 7 、C a M P K 阻断齐I J W 7 和M A P K 阻断帮J P D 9 8 0 5 9 所阻断，提示细胞增殖效应有c a “、P K C 、C a M P K 以及M A P K多途径的参与。而B M S C s 向肝细胞的定向分化过程主要通过哪些途径束实现的，是今后我们研究的重点。】8青岛人学坝I 。学位论芷第三部分骨髓基质干细胞移植对慢性肝损伤的影响1 材料与方法
14、1 I 主要试剂与材料1 1 1 实验动物2 0 3 0 9 成年小鼠4 6 只，1 1 2 主要试剂与实验用品四氯化碳( C C l 4 )尿嘧啶脱氧核苷( B r d U )雌雄不限，购自青岛大学医学院动物房。鼠抗人尿嘧啶脱氧核苷( B r d U ) 单克降抗体P V - 6 0 0 2 二步法免疫组化检测试剂浓缩璎D A B 试剂盒甲酰胺2 S S C1 1 3 试剂配制：天津大茂化学试剂厂武汉博士德生物技术有限公司北京中山生物技术有限公司北京中杉会桥，生物技术有限公司北京中杉会桥生物技术有限公司默克尔精细化学品有限公司 北京中杉会桥生物技术有限公司( 1 ) 0 0 1 MP B S
15、 ( p H7 4 、：N a C I8 9 ，K C I2 0 9 ，K H 2 P 0 40 2 7 9 ，N a 2 H P 0 4 1 2 H 2 02 8 7 9 ，溶解于双蒸水后，定容到1 0 0 0 m l 。( 2 ) 0 1 MP B ：0 2 MN a z H P 0 4 1 2 H 2 0 ( N a 2 H P 0 4 1 2 H 2 07 1 6 2 9 加双蒸水1 0 0 0 m 1 ) 4 5 0 m l 、0 2 MK H 2 P 0 4 ( K H 2 P 0 4 2 7 2 2 9 加双蒸水1 0 0 0 m 1 ) 5 0 m l 、双蒸水5 0 0 m
16、l ，即成0 1 MP B l 0 0 0 I l T l l 。( 3 ) 4 多聚甲醛：多聚甲醛4 0 9 ，加0 1 MP B 液5 0 0 m l ，加热至6 0 。C ，不断搅拌，并向其中滴加I NN a O H 至完全清晰，调p H 为7 2 ，冷却后向其中加入0 1 MP B至1 0 0 0 m l ，粗滤纸过滤，即成4 多聚甲醛1 0 0 0 r a l 。( 4 ) I N H C ! ：将双蒸水9 1 1 m l 加入H C I ( 比重1 8 ) 8 9 m l 中。1 1 4 主要实验仪器A 0 8 2 0 旋转石蜡切片机美国A O 光学仪器厂 全自动生化分析仪闩立7 1 8 0 型1 2 主要实验方法1 2 1 动物分组和慢性肝损伤病理模型的制备小鼠4 6 只，随机分为正常对照1 0 只( A 组) 、慢性肝损伤组1 8 只( B 组)
