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1、第三节：第三节： 下一代下一代测序技术与其他技术平台测序技术与其他技术平台 孟山都现代基因组选择辅助的精确耕种孟山都现代基因组选择辅助的精确耕种 (Genomic selection-assisted precision planting) 道格拉斯Array Tape利用SNP分子 标记对几万颗种子鉴定基因型 从种子上取一小块组织 种子（条形码编码）切割机器人 基因型选种 种植带有优良基因型 鉴定控制优良性状的基因 (基因组关联分析) 基因-性状连锁图 谱 候选材料的育种价 值 (GEBV)评估 对产量、抗性等性 状进行预测 基因组基因组选择辅助的精确育种选择辅助的精确育种策略策略 农艺性状
2、优良品种 (训练群体100) 基因组测序(基因型) 基因组选择预 测模型的构建 1. 线性回归模型 候选育种材料的收集 (候选群体 10,000) 基因组测序(基因型) 选择育种价值较高的材料 (实验群体 100) 0 设计大田育种实验方案 周期从7到8年缩短到3到5年 大数据技术支持 的组学数据挖掘 和育种平台 一、二、三代测序技一、二、三代测序技 术原理介绍术原理介绍 测序技术发展里程测序技术发展里程 第一代测序：Sanger法测序， 1970年，30亿美元测人类基因组（一条1 Kbp DNA序列） 第二代测序：(或新一代 Next Generation，或高通量测序 High-throu
3、ghput sequencing，或 并 行测序Parallel sequencing, 或深度测序Deep sequencing，或边合成边测序 Sequencing by Synthesis, 等很多名称) 1. 454焦磷酸测序 2004 （几万条读长200500nt） 2. Solexa测序 2006 （几百万读长36nt） 3. ABI SOLiD测序 2006 （几百万读长=50nt） 4. Illumina GA II 2007 (几千万条读长=70nt) 5. HeliScope单分子测序 2009 6. ION torrent 测序 2010-2014 （准三代，几十万条读长
4、=500nt） 7. Illumina HiSeq2000测序平台 2010-2013年 (几千万条100-nt短序列) 8. Illumina HiSeq2500, Next 500, MiSeq, X Ten系列，(1000美元一个基因组) 9. Complete genomics, BGI, (华大收购，个性医疗，500美元一个基因组） 第三代测序： （Third Generation or Single Molecule Sequencing，单分子测序) 1. Pacific Biosciences 单分子实时测序平台 2012 （几万条10kb序列=300 Mb） 2. Oxfor
5、d Nanopore纳米孔测序 2013 Illumina 测序仪的结构和基本术语测序仪的结构和基本术语 Flowcell: 流动槽, 盛有磁珠的芯片 Lane: 泳道, 每个流量槽里有8个通道 Library: 文库, DNA 或 cDNA 样本 Run: 一次测序操作需要一周，成本花费10万元 Read: 读长 Reaction: 加入一种颜色标记的碱基 Barcode: 在一条泳道里标记多样本 Base-calling: 识别碱基 read_1 ACGTCAGTACGGATGCTAGTCGGCACCATCATTGTGTC Illumina 测序原理测序原理 Adaptor 1 Adapt
6、or 2 DNA template Illumina HiSeq 系列测序仪系列测序仪 三代测序技术：三代测序技术：Pacific Biosciences 单分子测序仪单分子测序仪 SMRT 测序原理测序原理 1. 用4种荧光分别标记4种dNTP 2. 在测序芯片的底部做出许多用与入射光 波长相应的小孔，特定的孔径保证了入射 光在小孔中只以走很短的矩离。只够照到 正好与酶在相互作用的荧光dNTP底物 3. 把聚合酶锚定在测序芯片的底部 4. 让DNA链与酶结合，进行测序 5测序时，荧光dNTP与酶+DNA模板型成 复合物，短暂结合 6. 荧光dNTP被激光照射，发出荧光，荧 光被检测到 7.
7、酶反应过程，一方面使链延伸，同时使 dNTP上的荧光基团脱落 8. 聚合反应持续进行，测序同时持继进行 9. 用摄像机记录这个过程 SMRT (Single Molecule Real Time） Cell 拍摄萤光变化的电影 图像解码，推测序列 1、环形不易断裂，可以周而复始地测序，充分利用PacBio的读 长 2、插入序列的正向链和反向链都可以被读到，起到自我校正作用 3、两端的已知接头序列，可以用作计数器，用于计算模板被周而 复始地测了几次 SMRT SMRT 文库的构建（环形文库的构建（环形DNA)DNA) 读长很长读长很长，单条Read读长可以平均达到10kb，二代只有100bp 三
8、代与二代区别（三代与二代区别（1 1）：读长）：读长(read length)(read length) Benjamin A et al，nature，2010 三代与二代三代与二代区别区别（2 2） ：检测甲基化的碱基检测甲基化的碱基 A, C, G, T加入的时间间隔不一样，带有甲基化的位点，加入的碱基时间延迟 三代与二代三代与二代区别区别（3 3）：）：对对GCGC含量和重复序列差小含量和重复序列差小 2014， Nature 应用PacBio测序补齐人类基因组上的Gap，大多是高 GC含量区和重复序列 三代与二代区别（三代与二代区别（4 4）：方便检测可变剪切转录本）：方便检测可变剪
9、切转录本 二代二代 三代三代 无法准确区分每一个isoform 表达量 准确区分每一个Isoform产生的转录本 总结：一、二、三代测序平台比较总结：一、二、三代测序平台比较 X X X ? 其他基因型检测技术平台其他基因型检测技术平台 基于全基因组测序的方法 初步在一个群体里大规模筛查SNP 基于SNP芯片杂交的方法 仍属于大规模SNP筛选，用1百万个SNP筛查群体 基于目标测序的方法 目标基因比较明确，检测新的SNP 基于SNP位点设计引物扩增的方法（荧光和质谱） 已知明确的SNP标记致病基因 人类遗传病人类遗传病DNA检测技术的发展趋势检测技术的发展趋势 大规模重测序 GWAS鉴定SNP
10、 目标测序、疾 病检测模块 SNP芯片大 样本量筛查 2005 2010 2015 几千万美元 3. Gb全基因 组 几十万美元 500Kb SNP 几百美元 对于一种疾病 几十个基因， 几百个位点 一个反应对96个样本中的，6500个区段扩增，检测目标区段多态性 唐氏综合证产前筛查、耳聋基因筛查、癌症几率报告等等 SNP芯片设计和工作原理芯片设计和工作原理 正常 癌症 样品制备 荧光标记 杂交 扫描 数据分析 Affymetrix SNP芯片芯片 SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform 抗虫基因型: (AA) AC
11、GTGACGTGTAGGTCACTCTACCGTAGCGTCATGT ACGTGACGTGTAGGTCACTCTACCGTAGCGTCATGT 易感基因型：(aa) ACGTGACGCGTAGGTCACTCTACCGTAGCGTCATGT ACGTGACGCGTAGGTCACTCTACCGTAGCGTCATGT 杂合基因型：(Aa) ACGTGACGTGTAGGTCACTCTACCGTAGCGTCATGT ACGTGACGCGTAGGTCACTCTACCGTAGCGTCATGT (AA) X (aa) F1代： (Aa) x F1 (Aa) F2 代：(AA): (Aa):(aa) = 1:2
12、:1 以T和G作为SNP分子标记筛选带有AA基因型的植株 利用质谱的原理分离SNP，不 需要荧光标记，成本低通量高 maldi tof （飞行时间质谱原理）（飞行时间质谱原理） 利用分子量(MASS)大小不同的核苷酸、氨基酸片段 在电场里飞行的时间(time of flying)不同 DNA上样 最多384个样品 运行 数据分析 与数据库比较，预测 氨基酸序列 iPLEX 工作流程工作流程 引物1：TGTAGGTCACTCTACC 引物2：CGTAGGTCACTCTACC ACGTGACGTGTAGGTCACTCTACCGTAGCGTCATGT ACGTGACGCGTAGGTCACTCTACC
13、GTAGCGTCATGT 扩增扩增 引物设计引物设计 80% 为易感基因型 DNA (aa) 7% 为抗性基因型 DNA (AA) 13% 为杂合基因型 DNA (Aa) Sequenome genotyping 软件软件 LGC KASP genotyping assay 与Sequenome不同的是，需要荧光标记，成本较高 1. 在SNP位点设计Allele-specific 引物 2. 仅带有C引物的DNA被扩增出来 3. 仅带有C的DNA被加上荧光标记 CC 纯合基因型 CA 杂合基因型 AA 纯合基因型 KASP的免费软件的免费软件 SNPviewer 已知的所有致病已知的所有致病SNP 病人病人DNA样品样品 Douglas Scientific: Lab Automation 8小时 15万样品 Soellex High Throughput PCR Thermal Cycler Thermal Cycle 230,400 Data Points in a Single Run Araya In-Line Fluorescence Detection System 荧光扫描
