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1、 生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2008, October 25; 24(10): 1818-1823 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 2008 Institute of Microbiology, CAS Accepted: April 16, 2008 Supported by: the National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2004AA213072). Corres
2、ponding author: Yong Zhang. Tel: +86-29-87080085; E-mail: 国家高技术研究发展计划项目(“863 计划”) (No. 2004AA213072)资助。 * They are the co-first authors. 研究简报 通用型基因打靶载体的构建及其功能鉴定 陈兴启*, 孙达权*, 刘凤军, 贾淑玲, 张涌 西北农林科技大学动物医学院生物工程研究所, 杨凌 712100 摘 要: 为了构建适合大多数基因座位点打靶的通用型基因打靶载体及打靶成功后去除正选择标记基因, 以克隆载体pGEM-3Z 为骨架, 插入了一个正选择标记基因新霉素
3、磷酸转移酶基因(neo)、两个相同的负选择标记基因单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 HSV-tk1 和 HSV-tk2, 并在 neo 的两侧各添加了一个方向相同的 LoxP(locus of crossing-over (x) in P1)序列及两个不同的多克隆位点序列, 从而构建了载体 pA2T。插入的两个不同的多克隆位点序列中, neo 和 HSV-tk1 之间的多克隆位点序列有 8 个稀少的酶切位点、neo 和 HSV-tk2 之间的多克隆位点序列有 5 个稀少的酶切位点, neo、HSV-tk1 和HSV-tk2 有各自独立的转录单元。 脂质体法转染山羊成纤维细胞, 用遗传霉素(G418)和
4、丙氧鸟苷(GAC)进行正负筛选, 验证了正负选择标记基因的生物活性, 证明通用型基因打靶载体 pA2T 构建成功。载体 pA2T 转化组成性表达 Cre 重组酶(Cyclization recombination protein)的大肠杆菌 BM25.8, 检测到 LoxP 序列的生物活性, 结果表明 pA2T 中的正选基因可以被 Cre 重组酶去除。 因此, 本研究所构建的通用型基因打靶载体 pA2T, 根据不同的基因座设计同源臂后, 插入到 MCS中可直接用于不同基因座位点的打靶, 并能够在打靶成功后用 Cre 重组酶去除基因组中插入的 neo 基因, 为用基因打靶的方法制作转基因动物提供
5、了便利。 关键词: 转基因动物, 通用型基因打靶载体, LoxP 序列, Cre 重组酶 Construction of Universal Vector for Gene Targeting and Analysis of Its Function Xingqi Chen*, Daquan Sun*, Fengjun Liu, Shuling Jia, and Yong Zhang Institute of Biotechnology, College of Animal Veterinary Medicine, Northwest A 普通质粒载体虽然有较大的承载量, 但存在整合效率低和多
6、拷贝插入的缺陷; 而基因打靶载体可对细胞进行单拷贝基因定位修饰, 并且能够稳定的遗传。迄今为止用基因打靶的方法已经生产出了转基因牛、羊、鼠2, 68。基因打靶技术的关键步骤之一是基因打靶载体的构建, Mansoor等9提出的正负筛选基因打靶策略能很好的筛选打靶成功的细胞克隆, 正选标记基因用于筛选阳性克隆, 负选标记基因通过排除假阳性进一步富积阳性克隆。对于不同的基因打靶位点, 分别构建打靶载体涉及骨架载体的选择、 正负选基因的连接及鉴定、多克隆的设计、同源臂的插入等烦琐的过程。虽然出现了带有正负选基因及多克隆位点序列的通用型基因打靶载体10, 但是酶切位点太少限制了这些载体的应用范围。 现行
7、用基因打靶方法生产的转基因动物基因组中, 都整合有正选择标记基因新霉素磷酸转移酶基因(neo) 2, 68, 11, neo 的存在会影响中靶细胞及转基因动物个体的生长和正常生理状况, 同时增加了后期研究工作的影响因素。LoxP(Locus of crossing- over(x) in P1)序列由 2 个 13 bp 的反向重复序列和 1个 8 bp 的间隔区域构成。Cre 重组酶(Cyclization recombination protein)是一种位点特异性重组酶, 它能使 2个同向 LoxP之间的序列删除或重排12, 是由Sternberg 等13 于 1981 年从 P1 噬菌
8、体中发现, 属于 Int 酶超基因家族。由于 Cre 重组酶的表达可以进行精确的时空调控, 所以, Cre/LoxP 系统在基因打靶研究工作中有越来越多的应用14, 15。 本研究以克隆载体pEGM-3Z为骨架, 在其多克隆位点中插入了 1 个正选择标记 neo、2 个负选择标记 HSV-tk1 和 HSV-tk2, 并在 neo 的两侧各添加了一个方向相同的 LoxP 序列, 从而构建了载体 pA2T, 载体中包含有 2 个含有稀少酶切位点的多克隆位点, 并对此载体中的正负选择标记基因及 Loxp 序列的生物活性进行了研究。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 质粒和菌株 pGEM-T
9、easy载 体 和pGEM-3Z载 体 购 自Promega 公司, pMCIneoployA 载体购自 Stratagene公司, pORF-HSVtk 载体购自 Invivogen 公司, 大肠杆菌 DH5和大肠杆菌 BM25.8 由本室保存。 1.1.2 工具酶和试剂 各种内切酶购自 MBI 公司, 质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购自 Promega 公司, T4 DNA 连接酶、Klenow Fragment 和 CIAP 购自 TaKaRa 公司, G418购自Invitrogen公司, GAC购自Invivogen公司, DMEM和DMEM/F12购 自Invitrogen公 司
10、, Lipofectamine TM2000 购自 Invitrogen 公司。 1.1.3 合成和测序 引物合成与测序在 Invitrogen 公司, 多克隆位点序列在上海捷瑞公司合成。 1.1.4 山羊成纤维细胞 由本室冻存。 1.2 载体的构建 1.2.1 pGT和pTK的构建 Not I、Swa I 双酶切载体 pORFHSV-tk, 胶回收包括启动子及 polyA 序列的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk), Klenow Fragment 补平后克隆入 Sma I单酶切的载体 pGEM-3Z, 分别用 BamH I、 Sal I、 Pst I、Nhe I/Nco I 酶切载体,
11、 鉴定阳性克隆 pGT。设计引物 Ptk1(5-3): GGCCGCAATAAAAATCTTTATTT及 Ptk2(5-3): AAATGGATCTACCACATTTGTAGAG 1820 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech October 25, 2008 Vol.24 No.10 J G, 以 pORFHSV-tk 为模板扩增包括启动子及 polyA序列的 HSV-tk, 凝胶回收 PCR 产物并克隆入载体pGEM-Teasy 中, 分别 Pst I、 Not I 用酶切载体, 鉴定阳性克隆 pTK。 1.2.2 pGN的构建 合成一段含 Xb
12、a I、 Sgs I、 Bpu1120 I、 Bsp1407 I 、Nhe I、EcoR I、Not I、Xho I、BamH I、Sal I、Bsu15 II、Bst1107 I、Pf123 II、Spe I、Pst I、Sac II、Xba I 酶切位点的多克隆位点序列, 其中 Xho I 和 Sal I 两侧各有一段方向相同的 LoxP(5-ATAACTTCGTATAGCATA CATTATACGAAGTTAT-3), 合成的序列位于载体pGH 上。Xho I、Sal I 双酶切载体 pMCIneoployA 凝胶回收包括启动子及ployA序列的neo, 克隆入已用相应酶切的pGH中,
13、Xho I、 Sal I双酶切鉴定阳性克隆pGN。 1.2.3 pA2T的构建 Spe I、Sac II 分别双酶切载体 pTK 和 pGN, 分别凝胶回收 pTK 中的包括启动子及 ployA 序列的HSV-tk和 pGN 中的长片段, 连接 2 个回收片段, Spe I、Sac II 双酶切鉴定阳性克隆载体 pAT。Xba I 分别单酶切载体 pGT 和载体 pAT, 凝胶回收酶切载体 pGT并用 CIAP 去除 5端磷酸基团, 凝胶回收酶切载体pAT 中长片段, T4 DNA 连接酶连接 2 个回收片段, 分别用 Sac II、Sfi I、Kpn I、BamH I 酶切鉴定阳性克隆 pA
14、2T, 测序验证。 1.3 细胞转染和相关检测 1.3.1 遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GAC)筛选浓度测定 第 4 代山羊成纤维细胞分别加入浓度梯度的G418 和 GAC 筛选 1 周, 统计 G418 的最大致死浓度和 GAC 的最小致死浓度。 1.3.2 质粒转染 将pA2T按照LipofectamineTM2000使用说明书转染山羊第 4 代成纤维细胞。 1.3.3 质粒的抗药性检测 把转染的细胞分为 A、 B、 C、 D、 E、 F 六组, 按照测定的 G418 的最大致死浓度和 GAC 的最小致死浓度进行药物筛选, A 组为正常生长对照组, B 组为转染载体后培养液中加入 G4
15、18 筛选组, C 组为转染载体后 G418 和 GAC 筛选组, D 组为转染载体后GAC 筛选组, E 组为转染载体后正常培养组, F 组是不转染载体加入负选药物组。转染载体 24 h 后各组分别加入相应浓度药物, 1 周内观察筛选结果。 1.4 pA2T 转化大肠杆菌 BM25.8 将载体 pA2T 转化组成性表达 Cre 酶的大肠杆菌 BM25.8, 提取 BM25.8 中质粒命名为 pA2T2, BamH I 分别酶切 pA2T 和 pA2T2 凝胶电泳, 电泳检测, 比较两载体的酶切结果。用引物 Pneo1(5-3): CCAGGTCCACTTCGCATATTAAGGT及Pneo2(5-3): CGGATCCCCTCAGAAGAACTCGTCA, 分别以pA2T2和 pA2T 为模板进行 PCR 扩增, 电泳检测。 2 结果与分析 2.1 通用型基因打靶载体酶切鉴定及分析 2.1.1 载体pGT和载体pTK酶切鉴定及分析 HSV-tk 编码的蛋白产物以丙氧鸟苷(GAC)为底物, 将其代谢成对细胞有毒性的物质, 使细胞死亡, 而细胞中胸苷激酶基因编码的蛋白不能代谢 GAC, 根据这一原理基因打靶载体选用单纯疱疹病毒胸苷激酶基因做为负选择标记基因, 插入到同源序列的
