《丝孢酵母环氧水解酶的发酵优化及酶活测定新方法的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《丝孢酵母环氧水解酶的发酵优化及酶活测定新方法的研究（57页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、华东 理工大学硕 士 学 位 论 文第 I 页丝抱酵母环氧水解酶的发酵优化及酶活测定新方法的研究摘要对T r i e k o s p o r o n l o u b i e r i i ( 路比 利丝抱酵母 ) E C U 1 0 4 0 发酵表达环氧水 解酶进 行了 系统 优化。 研究表明， 缩水甘油苯基醚( P G E ) 可有效地诱导环氧水解酶的生物合 成， 但高 浓度 的P G E对细胞的生长有明显抑制作用。 在摇瓶培养中使用邻苯二甲 酸二丁酷溶解P G E ,维持培养基中较低的P G E浓度， 促进了酶的合成。 尽管甘油作碳源时比活最高， 但添加葡 萄糖能促进细胞的生长。微量元素对酶
2、的合成有显著影响。 通过添加葡萄糖和微量元素并 降 低培养基中磷元素的 浓度， 使摇瓶培养中 酶的 产量提高了 1 5 0 %。应用流加发酵策略， 将诱导 物P G E与营养物质一起进行流加， 使酶的 产量达到3 1 2 U / L ， 较优化前提高了6 .9 倍，比 活为2 3 .7 U / g D C W o高碘酸钠可氧化环氧水解酶的水解产物邻二醇， 残留的高碘酸钠氧化肾上腺素生成有 色的产物。 对高 碘酸钠一 肾上腺素显色法测定环氧水解酶活的条件进行了 考察。 吸光度O D 4 9 o 与 邻二醇浓度成线性关系。 用环氧水解酶粗酶 ( 丝抱酵母 E C U 1 0 4 0的无细胞提取物)
3、 对 新方法进行了检验。 环氧化物 ( 如P G E ) 、蛋白 质 ( 如牛血清白蛋白) 、 氯化钠和硫酸按对 反应没有千扰，表明此方法可应用于环氧水解酶纯化过程中酶活的快速测定。关 键 词 : 环 氧 水 #a 酵 屁产 酶 甜肾 上 麒硫舱法第n页华东 理工大学硕 士 学 位 论 文F e r m e n t a t i o n O p t i m i z a t i o n o f E p o x i d e H y d r o l a s e b y T r i c h o s p o r o n l o u b i e r i iE C U 1 0 4 0 a n d a N e
4、w Me t h o d f o r E p o x i d e H y d r o l a s e A s s a yAb s t r a c tT h e f e r m e n t a t i o n o f a n e p o x i d e h y d r o l as e b y T r i c h o s p o r o n l o u b i e r i i E C U 1 0 4 0 w a s o p t i m i z e d I t w as f o u n d t h a t p h e n y l g l y c i d y l e t h e r ( P G E
5、) c o u l d i n d u c e b i o s y n t h e s i s o f t h e e p o x i d e h y d r o l as e e ff i c i e n t l y , t h o u g h t h e a d d i t i o n o f P G E s t r o n g l y i n h i b i t e d c e l l g r o w t h . S o l v e n t d i b u t y l o - p h t h a l a t e w as u s e d i n f l as k c u l t i v
6、a t io n s t o d i s s o l v e P G E , k e e p in g a l o w c o n c e n t r a t i o n o f P G E i n t h e b r o t h , w h i c h e n h a n c e d t h e e n z y m e p r o d u c t i o n . G l u c o s e w as u s e d t o p r o m o t e c e l l g r o w th , t h o u g h g l y c e r o l g a v e t h e h i g h
7、e s t s p e c i f i c a c t i v i t y . T r a c e e l e m e n t s h a v e s i g n i f i c a n t e ff e c t o n e p o x i d e h y d r o l as e s y n t h e s i s . W i t h t h e a d d i t i o n o f t r a c e e l e m e n t s a n d g l u c o s e a n d a d j u s t m e n t o f p h o s p h a t e c o n c e
8、n t r a t i o n , t h e t o t a l a c t i v it y w as e n h a n c e d b y 1 5 0 %. T o f u r th e r i n c r e as e t h e e p o x i d e h y d r o l a c p r o d u c t i o n , a f e d - b a t c h c u l t u r e w i t h P G E i n t h e f e e d s o l u t i o n w a s p e r f o r m e d . T h e m a x i m u m
9、 v o l u m e t r i c a c t i v i t y o f t h e e p o x i d e h y d r o l as e w as 3 1 2 训， e n h a n c e d b y 6 .9 f o l d s t h a n t h e i n it i a l f e r m e n t a t i o n b e f o r e o p t i m i z a t io n . T h e s p e c i f i c a c t i v i t y w as 2 3 .7 U l g D C W ( d r y c e l l w e i g
10、 h t ) .T h e c o n d i t i o n f o r a c o l o r i m e t r i c as s a y o f e p o x i d e h y d r o l as e s b as e d o n t h e q u a n t i f i c a t i o n o f p e r io d a t e - s e n s it i v e r e a c t i o n p r o d u c t s ( v i c i n a l d i o l s ) b y b a c k - t i t r a t i o n o f t h e o
11、 x i d a n t w it h a d r e n a l in e w as i n v e s t i g a t e d . I t w as f o u n d t h a t t h e o p t i c a l d e n s i t y a t 4 9 0 r u n w as l i n e a r t o t h e c o n c e n t r a t i o n o f 1 ,2 - d i o l s . T h i s n e w m e t h o d f o r t h e as s a y o f a c ru d e e p o x i d e h
12、 y d r o l as e w as e x a m in e d u s i n g t h e c e ll - fr e e e x t r a c t o f T r i c h o s p o r o n l o u b i e r i i E C U 1 0 4 0 c u l t u re . F o r a r a p i d as s a y o f t h e e p o x i d e h y d ro l as e as s a y d u r i n g t h e p u r i fi c a t i o n p r o c e s s , t h e f e
13、as i b i l i t y o f t h i s m e t h o d w a s f u r t h e r c o n f i r m e d b y e x c l u d i n g t h e p o s s ib l e i n t e r f e r e n c e o f e p o x i d e s ( e .g ， P G E ) , p r o t e in s ( e .g ., b o v i n e s e r u m a l b u m i n ) , N a C l a n d ( N I 4 4 ) Z S O 4 .K e y w o r d s
14、 : E p o x i d e h y d r o l as eE n z y m e i n d u c t i o nS p e c t r o p h o t o m e t r y作者声明我郑重声明:本人悟守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文， 是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的结果。 除文中明确注明和引用的内容外， 本论文不包含任何他人已经发表或撰写过的内容。论文为本人亲自 撰写，并对所写内容负责。论 文 作 者 签 名 : 渗 江 日脚; 年5月护日华东理工大学硕 士学 位论 文第 1页第一章 绪论1 . 1 对映纯环氧化物的重要意义1 . 1 . 1 手性化
15、合物综述有机化合物中， 如果一个分子不能与其镜像重合， 该分子就被称为手性分子。 而若一 种化合物的两种立体异构体不能重合， 且互为镜像，则被称为对映异构体。当不存在外部 手性影响时， 除了 对平面偏振光的作用之外， 对映异构体具有完全相同的 化学和物理性质。 对映异构体可使平面偏振光发生程度相同、但方向相反的偏转。等量对映异构体的混合物没有旋光性，称为外消旋体。手 性是 现实世 界的 重要 特征，尤 其是对生命系统。生 物体内 的 许多分子， 如 ( D ) 糖， ( L ) 一 氨基酸 仅以 一 种对映形态存 在， 而由 这些小 分 子构成的 蛋白 质， D N A 等生 命 基 本组 成
16、 成分都具有特定的手性形态。 酶和各种受体分子，其本质都是具有手性的，外来的手性化 合物，比 如药物， 将与它的受体以手性的方式相互作用。 若以 外消旋体的形式给药， 两种 对映体在体内往往会以不同的途径被吸收、活化或降解。手性药物的不同对映体很可能以 不同的方式，与不同的受体参与作用并导致不同的效果。两种对映体可能有相同的药理活 性;或者一种可能是活性的，另一种可能是无活性甚至是有毒的:或者两者可能有不同 程度或不同种类的活性。因此，对手性化合物来说， 对映纯异构体的获得对于化学、生物学或药学的应用目 的 是必要的。 在药学上， 对映纯药物的应用可减少 服用剂量和减轻代谢负担， 提高剂量的 幅 度并拓宽用途， 对药物动力学及剂量能有更好的 控制， 在剂量设定时幅度更宽， 反 应较小; 在剂量选择时更有信心，减少与其它药物的相互作用，提高活性并减少剂量，提高专一性 并降 低由 其对映 体引 起的 可能的 副作用 I . 由 于手 性药物不同 对映体 可能 导致不同 的 效果， 美国F D A颁布法规， 将消旋体视为混合物， 必须对光学异构体的生理活性、 毒性等作用分别叙述
