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1、喀斯特峰丛洼地不同退耕模式土壤微生物多样性*何寻阳1, 2苏以荣1, 2梁月明1 , 2 , 4杨 珊1, 2 , 3王克林1, 2* *(1中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室, 长沙 410125;2中国科学院环江喀斯特农业生态试验站, 广西环江 547100;3中国科学院研究生院, 北京 100039 ;4广西师范大学生命科学学院, 广西桂林 541004)摘 要 利用变性梯度凝胶电泳和 Biolog_Eco生态培养平板技术, 调查了喀斯特自然退耕 ( NT, 撂荒 )、 人工种植经济林 ( CM, 木豆-板栗 )、 免耕 ( PI , 牧草- 任豆 )和传统耕作
2、( MB, 玉米- 大豆 ) 4种退耕模式下的土壤微生物遗传分类和土壤细菌代谢功能多样性. 结果表明: 退耕模 式显著影响了土壤微生物群落结构和细菌代谢模式, 其中真菌群落更依赖于退耕模式, 而细 菌群落对季节变迁更敏感; 短时期 ( 6 7年 )不同退耕模式下土壤中细菌遗传分类多样性没 有显著性差异 (P 0105), 经济林与牧草地土壤真菌遗传分类多样性显著高于撂荒和传统耕 作地 (P 0 . 1的读数为有效孔的数目, 但 2时调整至 2 , 光密度值 2虽不能反映土壤细菌的真实代谢潜力 20, 但其影响细菌功能多样性. 平均颜色变化率 (AWCD )的计算方法如下 20:AWCD =E(
3、Ci- R ) /n( 1)式中, Ci为每个有效孔的光密度值; R 为对照孔的光密度值; n 为总碳源数目 (B iolog_Eco平板其值为 31). 为降低接种密度不同造成的影响和稳定方差,分别对数据进行标准化 (式 ( 2) ) 和对数转换 (式( 3) ) 21.Ai= (Ci- R ) /AWCD( 2)Aic= ln(Ai+ 1)( 3)将转化后的数据用于主成分分析 ( PCA), 基于 各底物前 5个主成分的得分, 利用多元方差分析(MANOVA) 分析处理间细菌群落代谢功能的差异 19.微生物多样性指数均采用 Shannon -Weinner指数 (H c)表征:H c=E(
4、pi lnpi)(4)式中: pi分别为: a) 某一条带密度在所有条带密度中的百分比 22; b)有效孔与对照孔的光密度值差与整板总差的比值 16, 即: p i= (Ci- R) /E(Ci- R ).利用 ANOVA分析比较 12月样品的微生物多样性; 利用独立样本 t- 检验比较土壤微生物多样性 季节变化. 所有数据均在 Excel 2003软件中整理, 利用 SPSS 11 . 5软件完成.2 结果与分析211 不同退耕模式下土壤细菌和真菌群落 DGGE指纹DGGE指纹 (图 1)与聚类分析结果 (图 2)都表 明, 与土壤细菌群落相比, 土壤真菌具有较大的变异性和较明显的优势种群
5、(图 1b , 清晰而浓密条带 ),不同处理间土壤细菌和真菌的最小相似性分别为49 % 和 15 % . 土壤细菌群落可粗略分成 4组: 自然3192期 何寻阳等: 喀斯特峰丛洼地不同退耕模式土壤微生物多样性 图 1 不同退耕模式土壤细菌 ( a)和真菌 ( b) PCR -DGGE Fig. 1 DGGE fingerprints of PCR-a mplified bacterial16S ( a) and fungal18S ( b) rDNA sequences fro m directly extracted soilDNA under different de -far m ing
6、 patterns .M B : 玉米 /大豆 M aize /soybean ; PI : 牧草 /任豆 Pennisetum purpureum /Zenia insign; C M: 木豆 /板栗 Cajanus cajan /Castanea mollissima; NT: 撂荒地 Natural restoration land . 短线上方大写字母表示退耕模式, 数字为采样月份, 短线下方阿拉伯数字代表重复样品 Capital letters and Arabic nu - merals over short line denoted de-far ming patterns an
7、d sampling month, respectively, A rabic nu merals undershort line represented replicate soil samples . M、 CK 分别为 PCR-DGGE标准和阴性对照 M referred to the 100 bpDNA ladder forbacteria and a collection of previously detected fung, i respectively , CK for negative contro. l 下同 The same below.撂荒, 木豆- 板栗, 6月和 1
8、2月玉米- 黄豆, 牧草-任豆 (图 2a), 且比真菌群落具有较大的季节依赖性; 土壤 真菌群落大体上可分为 4 组: 自然撂荒, 木豆-板图 2 不同退耕模式土壤细菌 ( a)和真菌 ( b)的相似性 Fig. 2 Si m ilarity of soil bacterial( a) and fungal ( b) co mmu -nity fingerprints fro m four de -far m ing patterns.栗, 玉米-黄豆和牧草- 任豆 (图 2b), 且比细菌群落 具有较大的作物依赖性.212 不同退耕模式下土壤细菌代谢模式细菌的碳源利用模式反映了土壤细菌群落
9、的代 谢功能. PCA结果表明, 前 5个主成分累计方差贡献率为 7913 %, 第 1和第 2主成分分别解释 2618 % 和1910 % 的变异 (图 3), 细菌群落对碳源利用模式仅第 1主成分具有显著差异 (P 0101). 重要代谢底 物及其与第 1主成分的相关系数如表 2 , 结合图 1发现, 玉米黄豆地土壤细菌群落利用 D-纤维二糖( - 01638 , 与主成分 1的 Pearson相关系数, 下同 ) 和 B- 甲基-D- 葡萄糖苷 ( - 01710)的能力较其他处理强; 而利用吐温 80( 01843)、 腐胺 ( 01783)、 4 -羟基苯甲酸 ( 01774)、 丙
10、酮酸甲酯 ( 01693) 和吐温图 3 4个退耕模式主成分分析之 1、 2主成分排序 Fig . 3 Ordination biplot of the principal co mponent analysis on the substrate utilization patterns ofmicrobial co mmunities under four de -far m ing patterns derived fro m a Biolog_Eco plate assay .数值为 3个重复的各主成分得分均值及其标准误 Shown data were the means of thre
11、e replicatesw ith associated standard errors .320应 用 生 态 学 报 21卷表 2 土壤细菌代谢与第 1主成分相关显著的主要培养基 Tab . 2 M ain substrates with high correlation coefficients for PC1 in PCA on the substrate utilization patterns of bac - terial communitiesPC1r吐温 80 Tween 8001843腐胺 Putrescine017834 -羟基苯甲酸 4 -hydroxy benzoic
12、 acid01774吐温 40 Tween 4001768丙酮酸甲酯 Pyruv ic acid methyl ester01693D-纤维二糖 D-cellobiose- 01638B-甲基-D- 葡萄糖苷 B-methy- lD-glucoside- 0171040( 01768)的情况相反. 同一采样季节 ( 12月 ), 不同退耕模式下土壤细菌代谢模式差异显著 (F25, 31= 5178 , P 0101), 但 6月牧草- 任豆地与 12月自然撂荒地土壤细菌群落的代谢模式没有显著差异 (图 3).213 不同退耕模式下土壤微生物遗传和代谢多样 性的差异4种退耕模式土壤细菌代谢 (F
13、 = 51692 , P 0105)和真菌遗传多样性具有显著差异 ( F = 51377 ,P 0105), 而土壤细菌遗传多样性没有显著差异 (图 4). 多重比较结果表明, 牧草- 任豆地土壤细菌代谢功能多样性显著低于其他处理; 玉米- 黄豆地与自然撂荒地土壤真菌多样性显著低于牧草- 任豆和木豆-板栗恢复模式.对洼地玉米- 黄豆、 牧草- 任豆土壤细菌、 真菌遗传分类多样性和细菌代谢功能多样性进行 t- 检验,结果表明, 仅有细菌代谢功能多样性具有显著的季 节变化 (玉米-黄豆: t= 41370 , P = 01012 ; 牧草- 任豆: t= - 31107 , P = 01036 ,
14、 仅列出有显著差异的多样性比较, 图 5).图 4 12月不同退耕模式土壤细菌、 真菌遗传多样性及细菌 代谢多样性 Fig. 4 Soil bacteria,lfungal taxonomic and bacterialmetabolic diversities under four de -far m ing patterns in December .不同字母表示处理间差异显著 ( P 0105) D ifferent letters meant sig- nificant difference at 0 105 level by ANOVA among treatments . : 细菌
15、 代谢 Bacterialmetabolic diversity; : 细菌遗传 Bacterial taxonom ic d- i versity; : 真菌遗传 Fungat taxonom ic diversity.图 5 土壤细菌代谢多样性的季节变化 Fig . 5 Seasonalvariations of soil bacteriametabolic diversity .不同字母表示 t检验差异显著 ( P 0105) D ifferent letters meant sig - nificant difference at 0 105 level by t-test .3 讨
16、论311 不同退耕模式下土壤细菌、 真菌群落与细菌代谢模式 土壤细菌和真菌群落对不同退耕模式响应不一致: 土壤细菌组成对季节变化响应比真菌敏感, 而土壤真菌组成对退耕模式响应比细菌敏感 (图 1 , 2).研究表明, 土地利用历史 23、 采样时间 24比农业管理措施对土壤细菌群落组成的影响更重要, 本研究的 4种退耕模式在退耕之前具有相同的利用历史(玉米- 黄豆地 ), 在同一季节, 土壤细菌群落受到退耕模式的影响 (图 2), 但土壤细菌群落对较短时期( 6 7年 )退耕响应没有季节变化引起的效应大, 说明因季节和地上植物生长周期的变化引起的土壤性 质如含水量、 温度和有机质的有效性等的变化对土壤细菌群落具有重要作用. 另一方面, 尽管土壤真菌丰度和多样性受到采样季节引起的土壤化学性质和气候上的干扰 25, 但与细菌相比, 真菌可以通过浸染酶解木质叶和溶解菌丝而获得可利用资源 26, 且对土壤碳源的利用更为有效 2
