《小剂量一氧化氮在小鼠卵母细胞成熟中的作用及分子机制的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《小剂量一氧化氮在小鼠卵母细胞成熟中的作用及分子机制的研究（47页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、独剑性声嘲本人声翳耩呈交的学位论文楚本入在导辩指导下避孪亍瀚礴究工撵及取餐酌研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和数谢的地方外，论文中不包台其经A 已经发表葳溪麓过翡骚究成紧，戆不包禽为获褥寿葵史学或筵毽教育辍构的学位或证书雨使用过的材料。与我一同工律的同志对本研究所做的任何贡献均己褒论文中作了鞠旒熬浇锈并袋示谢意。学位论文佟纛整名：两掇乞签字爨鬃：硎年舌鼹莎露学位论文舨权搜髑授权书本学位论文作糟完全了解南昌太学有关保留、饿埔学位论文的规定，有权保留并蠢强家蠢关部门或秘稳送交捷文戆复印件裟磁爨，允许论文被套阕巍倍阕。本人授权南蕊点学可以将学位论文的金部或部分内容编入膏美数据瘁避行检索，可以
2、采用影印、缩E p 溅扫撼等复制手段保存、汇编学位论文。( 豫密斡学位论文在旗密露适用零授权书)学位论文作者签名；签- $ R N ：潮6 每两丑乏6 莛磐瓣学佼论文终者孥监螽去彝：工作单位：通讯媳垃：导师签名：扦同篱签字弱熬：汹年5 霹? f 嚣电话：辩编：小剂量一氧化氮在小鼠卵母细胞成熟中的作用及分子机制的研究研究生：高风兰导师：郑月慧南昌大学医学院生理学教研室 摘要目的：观察不同浓度一氧化氮( n i t r i co x i d e ，N O ) 供体硝普钠( s o d i u mn i t r o p r u s s i d e ，S N P ) 与一氧化氮合酶( N O S )
3、抑制剂左旋硝基精氨酸甲基酯( N W - n i t r o - L a r g i n i n em e t h y le s t e r ，L N A M E ) 对小鼠生发泡( g e r m i n a lv e s i c l e ，G V ) 期卵母细胞体外成熟的影响；在适宜浓度的N O 、或弄口L N A M E 、或和二丁酰环腺苷酸( d i b u t i r y lc y c l i c A M P ，d b c A M P ) 、或和孕酮( p r o g e s t o n e ，P ) 共同作用下，观察卵母细胞体外成熟的情况并分析它们之间的相互关系；在N O 、L N
4、 A M E 、d b c A M P 、P 等不同处理因素作用下，利用R T - P C R 技术检测卵母细胞成熟过程中C e r b B 2 m R N A 表达的变化。利用W e s t e r n - b l o t t i n g 技术检测卵母细胞中成熟促进因子( m a t u r a t i o n p r o m o t i n gf a c t o qM P F ) 的调节亚基细胞周期蛋白B ( c y c l i n B ) 的合成变化、丝裂原激活蛋白激酶( m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e
5、 ，M A P K ) 的活性变化。为进一步了解的卵母细胞发育、成熟机理及其调控增添新资料，为开辟新的促生育和抗生育途径提供实验依据。方法：给予3 4 周龄健康雌性未成年昆明小自鼠腹腔注射P M S G8 1 U 。4 4 4 8 d 时后断头处死，取双侧卵巢，在体视显微镜下用已消毒的4 号针头小心剔除卵巢周围脂肪和结缔组织，刺破卵泡，释放出卵丘卵母细胞复合体( c u m u l u sc e l l e n c l o s e do o c y t e ，C E O ) 。用V I 径大于复合卵直径的1 2 1 吸管吸取形态完好的G V 期C E O ，反复漂洗3 次，移入每孔装有9 5
6、0 p l 培养液，并加入不同处理因素的4 孔培养板内，每孔4 0 一5 0 个左右卵母细胞。在3 7 。C 、5 C 0 2 、9 5 空气、1 0 0 湿度的培养箱内培养1 2 h 。观察不同处理因素下，不同时间G V B D 发生率和P B l 排出率从而判断卵母细胞的成熟惨况。结果：( 1 ) 小刘量一氧化氮供体S N P 对卵母纲胞的成熟无 乍用。1 0 4 魏均乩、1 0 。m o l L 、10 。m o l L 的S N P 组与对照组比较，6 h 卵母细艟生发泡破裂( g e r m i n a lv e s i c l eb r e a k d o w n G V B D
7、) 率与1 2 h 第一极体排出( F i r s tp o l a rb o d y , P B l ) 率均无显著性差别( P 0 。0 5 ) ( 2 ) L - N A M E 擗露l 卵母缨魏体羚成熟，观察发现1 0 m o l L 、1 0 弓m o l LL ，N A M E 与对照组比较，卵母细胞生发泡破裂( G V B D ) 率与第一极体( P B l ) 排出率均有所降低( P 主要试荆l 、孕马血清德馁艨激素( p r e g n a n tm a r e ss e r u n lg o n a d o t r o p h i n ，P M S G ) ：购自天津市华孚
8、高新生物技术公司，1 0 0 0 I U 支。2 、M 1 9 9 培养滚( S i g m a ) 枣黯) ：蠹壹l e 。3 B S A ( b o v i ns e r l l n la l b u m i n ，宰斑滚基蛋白，购l ! l G I B C O 公司) 、1 0 0 I U m l 青霉索、l O O g g m l 链霉素一b 覆矿物油( S i g m a产繇) 。3 、硝普钠( s o d i u mn i t r o p m s s i d e ，S N P ) S i g m a f l 2 黼4 、左靛磋基精氨羧擎墓酝( N W - n i t r o - L
9、 - a r g i n i n em e N y le s t e r ，L - N A M ES i g m a 产箍5 、二丁酰环腺替酸( d i b u t i r y lc y c l i cA M P ，d b c A M P ) 、：美酾S i g m a 诧学公司产鼎。，j ? 孕酮( P r o g e s t e r o n e ) ：美黼S i g m a , f 艺学公司产晶。? 、R T - P C R 试粼：( 1 ) T r i z 0 1 T a k a r a ? 3 ：鼹。( 2 ) T a q 酶：P r o m 锷嚣产黪，1 0 0 I I J 支。 枣
10、鬣摭c y c t i n B l 攀巍隆藏体：S a n t a C r u z 公司誓) H R P 拣记羊撬鬣I g G ：茨阂S i g m a 公司( 7 ) E C L 发光液：美国P ie r c e 公司。( 8 ) 3 0 丙烯虢胺溶液配制：翁烯酰胺2 9 9 ，双丙浠酰羧l g ，阻溢热去离予求溶解，定容至l O O m l ，p H 6 5 ，棕色甄申避光傈存。9 ) 5 i r i s - 甘氨鼗露泳缓冲渡( p H 8 3 ) ：T 6 s1 5 ，l g , 甘氮酸9 4 9 1 0 S D S5 0 m l ，加去离子水定容至1 , 0 0 0m l ，用时稀释5
11、 倍。( 1 0 ) 2 S D S 凝菠翔榉缓冲液：1 0 0 m m o l LT r i s ，H C l ( p H6 。8 ) ，2 0 0 m m o l L 二巯苏糖黪f B Y r ) ，4 S D S ，0 。2 溪酚蘸，2 0 甘油。( 1 1 ) 转移邀泳滚浆剡：4 8 m m o l L T f i s ，3 9 m m o l L 甘戴酸，0 0 3 7 5 S D S ，2 0 0 m l 警醇，总体竣1 , 0 0 0 m l 。先预冷，麓静翻入转移电泳槽内。( 1 2 ) T B S 配翻：T r i s 2 。4 2 9 , N a C I8 9 ，1 M H
12、 C t3 8 m l 以8 0 0 m l三蒸水溶解，调节p H 至7 6 ，定容至1 , 0 0 0 m l ，根据需臻加入0 1 T w e e n 2 0 ( 13 )配制1 0 分离胶，5 浓缩胶：( 三) 实验动物：选择3 - 4 周龄熬藤雄往未成年墓臻小蠹鬣，体重1 5 1 8 9 。叁江疆医学院动科部提供，合格证号为0 2 2 9 5 3 7 。二、方法( 一) 渤物处理：给予3 - 4 闵龄健康雌性未成年昆明小趣鼠黢整注射P M S G 8 I U 。4 4 - 4 8 d 、时后断头处死，取双侧卵巢，在体视显微镜下用已消潦的4 号针头小心剔除卵巢周骥脂肪和结缭组织，刺破辩泡
13、，释放浅C E O 。( 二) 复合卵体外培养：用弱径大于复合卵壹径的朗吸管吸取形态完好的G V期C E O ，反复漂洗3 次，移入每孔装有9 5 0 p l 培养液，并加入不同处理因素的4 孔培舞摄内，每孔4 0 一5 0 个左右穿母缨胞。在3 7 。C 、5 C 0 2 、9 5 空气、1 0 0 湿度的培养箱内培养1 2 h 。( 三) 成熟率测定：观察不同处理因素下，不同时间卵母细胞的成熟。分别计算G V B D 发生率葶 I P BI 搀爨率。( 四) R T - P c R 测卵母细胞中的c - e r b B ：m R N A 变化1 0l 、卵母缀麓总心A 盼提瑕韵整怒：主要步
14、骤包括f 1 ) 各耱爨具鲶凳莲：玻璃器蕊缝2 5 0 干烤4 h ，塑料铡晶经1 粼P C 液浸泡过彼，再高压灭菌，所掰试裁用0 ，t D E P C 液处理显经蔚压灭菌的三蒸水懿铡，在整个操作过程露戴蹦耀和无菌手套，以减少R N A 濂的污染。( 2 ) 憨R N A 的摄墩过程：分离1 5 0 0 个辩母缨憨，分盛5 组，分割为对照筑、d b c A M P 组、P + d b c A I v l P 组、默舶c A M P + S 攀组稚辨d b e 怂口+ S + L _ N A 溉缀。在3 7 、5 C 0 2 、9 5 空气、l O O 湿度的培养箱内培养黼后，加入o 5 m t
15、 T r i z o l ，剧烈震荡簸鸯O 1 m l 氯傍，铡黧摇晃1 5 s ，以1 0 0 0 0 9 ，4 离心2 0 m i n 。转移水相，加预冷的异丙酵，放置1 0 m i n ，1 0 0 0 0 9 ，4亵, 0 2 0 m i n ，离心嚣在豢疯冤R N A 黢片状沉淀。经7 5 豹乙黪洗魏螽，R N A漉淀物在室瀑下鑫然子燥，震O 1 的D E P C 承1 5 0 1 溶鳃矮5 6 水浴t o m i n 。( 3 )R N A 纯度鉴定：用核酸蛋白分析仪测定波长2 6 0 n m 及2 8 0 n m 处的光密度( O D )蓬，O D z 6 # O E h s 。
16、大予i ，7 致主方可瘸予逆转隶。( 4 ) R N A 质量鏊定：联5 照蕊R N A提取液于2 O j 刻揩糖凝胶上进行电泳，紫外透射仪观察18 S 着0 2 8 SR N A 条带的完整性。2 、逆转录：提取藤总R N A l o p t i J H ) k 3 p l O l i g o ( 积) ，褥辫霄5 m i n ) 唾n 置予冰上5 m i n 。依次加M 小v 逆转漾酶1 u l 、M M L VB u f f e r 5 p l 、R n a s ei n h i b i t o r l p l 、d N T P I 。5 0 1 ，D E P C 隶翔楚2 5 0 1 ，3 7 承浴6 0 m i n ，合成c - D N A 。3 、P C R ：爱应体系为C D N A5 0 1 、正爱义雩l 秘( 霹酶葶l 物鞍B - A c f i n ) 各1 0 1
