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1、山东大学硕士学位论文多西他赛脂质纳米混悬剂的研究姓名：王丽丽申请学位级别：硕士专业：工程硕士（制药工程）指导教师：张娜；邵伟20120521山东大学硕士学位论文多西他赛脂质纳米混悬剂的研究研究生：王丽丽导师：张娜教授中文摘要近年来恶性肿瘤的发病率和死亡率一直呈明显上升趋势，用于恶性肿瘤治疗的方法主要包括放射治疗、手术治疗和药物治疗，其中对于实体瘤和转移肿瘤的治疗，药物治疗占有重要地位，特别是肿瘤化疗取得了很大程度上的进步。多西他赛是目前广泛研究应用的一种新型紫杉烷类抗肿瘤药物f l 】，其作用机制是通过刺激导管素的聚合，加强微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，导致形成稳定的非功能性微管束，因而
2、破坏肿瘤细胞的有丝分裂【2 1 。多西他赛在临床上被广泛地应用于卵巢癌1 3 1 、乳腺癌【4 1 、非小细胞肺癌【5 1 和其它【6 】多种癌症的治疗。但多西他赛由于溶解度差、生物利用度低及毒性大等使其临床应用受到限制，目前I 晦床应用的剂型仅为注射液，泰索帝 和多帕菲 ，该注射剂含有大量非离子表面活性剂T w e e n - 8 0 。其中药物本身或吐温8 0 会引起严重的过敏反应如过敏反应，体液潴留，神经、骨骼肌肉毒性和中性粒细胞减少症等【7 】，限制了其临床应用。因此，研究、探索新型高效、低毒药物给药系统成为药剂学研究热点之一。本课题旨在研发新的给药系统提高多西他赛的水溶性，避免吐温8
3、 0 表面活性剂的使用，同时选择合适的肿瘤靶向因子将抗癌药物专一性或选择性的输送到肿瘤组织，减少药物在正常组织器官的分布，降低其对正常组织器官的毒副作用，利于未来用于癌症的治疗。本研究课题首次制备三种不同类型的可生物降解的脂质纳米混悬剂：一、被动靶向多西他赛脂质纳米混悬剂( D T X 1 i p i d b a s e d d o c e t a x e l n a n o s u s p e n s i o n s ，D T X L N S ) ；二、长循环多西他赛脂质纳米混悬剂( p L N S ) ；三、叶酸介导的主动靶向多西他赛脂质纳米混悬剂( t L N S ) 。本课题对这三种多
4、西他赛脂质纳米混悬剂进行了系统的理化性质研究、药效学评价，以及体内药代动力学行为和体内组织分布行为研究，研究内容与结果如下：山东大学硕士学位论文一、多西他赛脂质纳米混悬剂药物含量测定方法的建立采用高效液相色谱法测定多西他赛脂质纳米混悬剂中多西他赛的含量，并对方法学进行了研究。结果表明此方法简便快速、灵敏度高、专属性强，能准确测定多西他赛的含量。二、被动靶向多西他赛脂质纳米混悬剂的研究采用高压均质法制备D T X - L N S ，采用冷冻干燥法以甘露醇作为冻干保护剂制备D T X L N S 冻干制剂。使用透射电镜观察粒子外观形态，Z E T A S I Z E R 3 0 0 0 激光粒度分
5、布与电势分析仪考察其粒径、粒径分布。采用透析袋法考察其体外释药行为。肿瘤细胞毒性研究中，以多西他赛市售注射液多帕菲 为对照组，采用噻唑蓝比色法( M T T法) 测定多帕菲 、D T X L N S 和B l a n k L N S 对卵巢癌细胞株( S K o v - 3 ) 和小鼠黑色素瘤细胞株( B 1 6 ) 的细胞毒性作用。药效学研究中，进行T D T X L N S 与市售多帕菲啦射液对荷小鼠黑色素瘤( B 1 6 ) 昆明鼠的体内抗肿瘤效果的比较。试验结果显示在优化条件下采用高压均质法制备D T X L N S ，制得的纳米混悬剂粒子形态规整，平均粒径为2 0 0 0 4 - 3
6、 4 2a m ，z e t a 电位为1 1 1 5 4 - 0 9 9m V ，稳定性好。多帕菲 与D T X L N S 体外释药均符合一级动力学数学模型，释放曲线拟合方程分别为：D T X L N S ：l n ( 1 0 0 Q ) =O 1 9 6 1t + 4 5 5 4 3 ，r = O 9 9 4 6 ，多I 怕菲 ：I n ( 1 0 0 Q ) = 0 1 8 5 9t + 4 4 0 3 8 ，r = 0 9 9 9 1 。多西他赛脂质纳米混悬剂的细胞毒性与多帕菲 注射液的细胞毒性相当。体内药效学研究结果表明，与多帕菲 ，L N S 作为抗肿瘤药物载体可通过被动靶向作用
7、，使药物蓄积于肿瘤部位，增强药物的抗肿瘤作用同时降低药物对正常组织的毒副作用。采用高压匀质发制备的D T X - L N S ，可进行产业化生产，粒径小，体内抑瘤效果好，毒性低，是一种具有开发上市潜力的药物新剂型。三、长循环和主动靶向多西他赛脂质纳米混悬剂的研究采用高压均质法以P E G 修饰的脂质载体材料制得表面有P E G 修饰的长循环脂质纳米混悬剂( p L N S ) 。利用叶酸上的羧基与D S P E P E G 上的氨基通过D C C 反应制得D S P E P E G F A ，将D S P E P E G F A 掺入脂质载体材料中成功制备主动靶向脂质纳米混悬剂( t L N
8、S ) 。使用透射电镜观察粒子外观形态，Z E T A S I Z E R 3 0 0 0 激光粒度分布与电势分析仪考察其粒径、粒径分布。采用透析袋法考察其体外释药行为。肿瘤细胞毒性研究中，采用噻唑蓝比色法( M n i 去) 研究多帕菲 、p L N S 、t L N S 、B l a n k - p L N S 和B l a n k - t L N S 对细胞表面低表达叶酸受体的肿瘤细胞人肝癌细胞株( H 印G 2 ) 和细胞表1 4山东大学硕士学位论文面高表达叶酸受体的肿瘤细胞小鼠黑色素瘤细胞株( B 1 6 ) f l 懈胞毒性作用。药效学研究中，进行T p L N S 、t L N
9、S 与市售多帕菲 注射液对荷小鼠黑色素瘤( B 1 6 ) 昆q J 鼠的体内抗肿瘤效果的比较。药物代谢与组织分布研究中，比较p L N S 、t L N S 与市售多帕菲固在荷小鼠黑色素瘤( B 1 6 ) 昆f l f J 鼠中的分布，并进行靶向性评价。本部分制得的p L N S 、t L N S 的平均粒径分别为2 0 4 2 士6 1 8n m 、2 2 0 6 - J ：9 5 4n m ，z e t a 电位分别为3 3 8 3 + 0 3 5m V 、2 7 8 0 - a ：O 7 7 m V 。体外释放均符合一级动力学数学模型。肿瘤细胞毒性试验结果表明，与多帕菲 相比，两种脂
10、质纳米混悬剂的抗肿瘤活性明显增强。对于主动靶向制剂组，t L N S 对B 1 6 细胞的I C 5 0 值明显低于p L N S 的I C 5 0值( P 9 5 ，p H = 5 0 7 0 ，上海太伟药业) ；聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺( D S P E P E G 2 0 0 0 ，美国A v a n t iP o l a rL i p i d s 公司)聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺( D S P E P E G 2 0 0 0 - N H 2 ，美国A v a n t iP o l a rL i p i d s 公司) ；实验用水为M i l i p o r e 超纯水；甲醇( T
11、 e d i a 色谱纯) ；乙腈( T e d i a 色谱纯) ；0 2 2 l x m微孔滤膜( 上海市新亚净化器件厂) ；无水乙醇( 天津市大茂化学试剂厂，批号2 0 0 6 1 1 0 1 ) ；氢氧化钠、磷酸二氢钾等均为市售分析纯试剂。2 仪器D I A X 9 0 0 匀浆机( 德国I K A 公司) ；高压匀质机N S l 0 0 1 L ( 意大利G E AN i r oS o a v i公司) ；S H B I I I 循环水式多用真空泵( 郑州长城科工贸有限公司) ；A L l 0 4 - 1 C 精密分析天平( 瑞士梅特勒公司) ；T D Z A w S 低速台式离心机
12、( 湘仪离心机) ；L C 1 0 A T V P O D S 高效液相色谱仪( 日本岛津) ；S P D 1 0 A V P 紫外检测器( 日本岛津) ；U V - 2 1 0 2 P C S 型紫外可见分光光度计( 美 U N I C d 啪) ；P H S 3 C 型精密p H 计( 上海雷磁仪器厂) ；e p p e n d o r f 移液器( 德国E p p d o 凇司) ；G L 8 8 1 3 旋涡混合器( 江苏海门其林医用仪器厂) 。二、试验方法l 多西他赛脂质纳米混悬剂体外含量测定方法的建立本课题采用高效液相法测定脂质纳米混悬剂中多西他赛的含量。山东大学硕士学位论文1 1
13、 检测波长的确定精密称取适量多西他赛对照品，加乙腈一蒸馏水混合溶液( 6 5 ：3 5 ，V ) 溶解并稀释成每lm l 中含2 0 嵋的溶液，照紫外一可见分光光度法( 中国药典2 0 1 0 年版二部附录A ) ，以混合液为空白对照，于2 0 0 - - 一4 0 0n m 波长范围内对其进行扫描，考察紫外吸收情况。称取注射用大豆磷脂适量同法操作，于2 0 0 “ - - 4 0 0 n m 范围内进行波长扫描。1 2 色谱条件参考相关文献【1 8 】，本课题采用高效液相色谱法( H P L C 法) 测定脂质纳米混悬剂中多西他赛的含量。1 3 标准曲线的建立取多西他赛对照品适量，精密称定，
14、用适量流动相溶解配制成浓度为1m g m L的贮备液，精密吸取贮备液适量用流动相稀释成浓度分别为5 0 ，10 0 ，2 0 0 ，3 0 0 ，4 0 0 和5 0 0 p g m l 的6 个浓度的工作液，按照1 2 项下的色谱条件，测定，记录色谱图，以峰面积A 为纵坐标，多西他赛浓度C ( 斗g m 1 ) 为横坐标进行线性回归得回归方程。1 4 最低检测限和最低定量限的测定采用基线信号与噪音比的分析方法，以2 3 0n r n 为检测波长，把一系列已知多西他赛标准品低浓度溶液分别进样2 0 弘I ，将溶液测出的信号与噪声信号进行比较，以信号噪音( S N ) = 3 ：1 时相应的浓度
15、为最低检测限，以信号噪音( S N ) ：1 0 ：1 时相应的浓度为最低定量限。1 5 日内、日间精密度配制低、中、高( 5 0 3 0 o 5 0 0p g m i ) 三个浓度的标准溶液，进行色谱分析，记录峰面积，计算多西他赛含量。一天内重复进样5 次，计算日内精密度；一天进样l S ，连续进样5 天，计算日间精密度。山东大学硕士学位硷文1 6 方法回收率取低、中、高( 5 0 ，3 0 0 ，5 0 0p g m 1 ) 三个浓度的对照品溶液，进样2 0 “l ，测定峰面积，代入标准曲线方程求得溶液实际测定浓度，计算方法回收率和R S D 值。1 7 加样回收率按处方量的8 0 、1
16、0 0 、1 2 0 称取多西他赛原料药适量，分别加入处方量的辅料，加甲醇溶解后定容，摇匀，配制成浓度分别为4 0 0 、5 0 0 、6 0 0 肛咖l 的样品溶液，进样2 0p l ，测定峰面积，代入标准曲线方程求得实际测定浓度，计算加样回收率和R S D 值。2 多西他赛脂质纳米混悬剂载药量的测定载_ 药量( D r u gL o a d i n g ，D L ) 是指纳米粒中药物占有的的重量百分率，其高低决定着临床上给药量的多少。载药量低，则临床上需给药量大，那进入人体的载体和制剂的量也就多。因此，在保证制剂符合标准的情况下，载药量应尽量提高，以减少临床给药剂量，提高病人的顺应性。2 1 纳米混悬剂中药物的含量测定精密吸取多西他赛脂质纳米混悬剂，加甲醇破乳，涡旋，进样2 0 斗l ，进行H P L C分析，记录峰面积，计算纳米混悬剂中
