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1、子宫内膜整合素1 33 亚基的表达对体外受精一胚胎移植妊娠结局的影响硕士研究生：徐华指导教师：闫素文教授 指导小组：张宁教授鲁海鸥副教授 周敏副教授专业名称：妇产科学摘要随着体外受精一胚胎移植( I V F - E T ) 技术的广泛开展，如何提高妊娠成功率已成为这项技术面临的最大问题。胚胎种植是极其复杂的过程，良好的子宫内膜容受状态和与胚胎发育的同步化是种植成功和提高妊娠率的关键因素之一。整合素是一群细胞表面黏附分子，由a 、B 亚基构成，介导细胞之间及细胞与细胞外基质之间的黏附和信息传导。其中整合素B 。亚基特异性地表达在胚胎着床“窗口期”( 排卵后的7 一1 0 天) ，与多种原因的不孕
2、症有关，被认为是一种评价子宫内膜一胚胎容受性( E E R ) 的良好指标。目的：探讨I V F E T 患者中子宫内膜整合素t 33 亚基的表达与妊娠率的关系。方法：采用免疫组织化学的方法检测3 3 例行I V F E T 的不孕症患者( 不孕症组) 及9 例有正常生殖能力妇女( 对照组) 着床窗口期子宫内膜整合素口3 亚基的表达，同时亦采集了这些病人其它临床信息，均用于评价与I V F E T 妊娠率的关系。数据分析采用S P S S I O 0 软件，临床资料采用小样本t 检验及L o g i s t i c 回归分析，等级资料用秩和检验，计数资料用确切概率法。结果：1 整合素D3 亚基
3、主要表达在子宫内膜表面腔上皮及腺上皮的细胞浆，间质中亦有少量表达。2 3 3 例患者行3 V F E T 后有7 例临床妊娠，妊娠率为2 1 2 。妊娠组较非妊娠组在患者的平均年龄、基础内分泌水平、取卵个数、受精率、移植胚胎个数、胚胎质量评分、移植日子宫内膜厚度及超声学类型、平均的I V F E T 周期数方面均无显著性差异( P O 0 5 ) 。对照组和妊娠组子宫内膜整合素B3 亚基表达明显高于非妊娠组，统计学意义显著( P O 0 5 ) 。3 统计不孕症类型中发现3 3 例患者中1 7 例为继发不孕，1 6 例为原发不孕。妊娠组的7 例均为继发不孕患者，原发病例无一例妊娠成功，差异显著
4、( P 0 0 5 ) T h ee x p r e s s i o no fi n t e g r i n l 3 3i ne n d o m e t r i u mw a ss i g n i f i c a n t l ye l e v a t e di np r e g n a n tg r o u pa n dc o n t r o lg r o u p ( P 1 6 m m 时，H C G l 0 0 0I u 肌注。3 6 小时后阴式B超监控下、经阴道穿刺取卵。精、卵体外受精体外培养7 2 小时，据患者年龄选择2 3 个4 8 细胞的胚胎移入宫腔。移植当天开始予以黄体支持，采用
5、黄体酮肌注( 4 0 m g d ) 。2 3 整合素1 3 。亚基的检测2 3 1 标本采集及处理：所有研究对象均于促排卵前的1 3 个自然月经周期的中期行阴式B 超监测排卵，在排卵后7 一l O 天行子宫内膜诊刮，于宫底部刮取约“黄豆粒”大小内膜组织直接置于t 0 的福尔马林溶液中固定，常规石蜡包埋，腊块保存备用。6 2 3 2 试剂：兔抗人的整合素0 。亚基单克隆抗体、即用型S A B C 免疫试剂盒及显色试剂均购于武汉博士德生物技术公司。整合素B ，亚基的工作浓度为1 ：1 0 0 。2 3 3 免疫组织化学S A B C 法：蜡块连续切成4u m 厚切片，每份标本作3 张切片，分别贴
6、附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，1 张行苏木素一伊红( H E ) 染色进行组织学分期，如与月经周期相符，则另两张行免疫组化染色。3 结果判定3 1 免疫组化结果判定采用双盲法进行显微镜下观察。参照王鲁6 等人标准，结果均以高倍光镜( 2 0 0 ) 下细胞内出现棕黄色颗粒为阳性，按上皮细胞着色强度及阳性细胞分布范围分为4 个等级：无细胞着色( 一) ：1 0 3 0 细胞呈弱、中等强度阳性反应( + ) ；3 0 细胞呈强阳性反应或3 0 6 0 细胞呈弱、中等强度阳性反应( + + ) ： 6 0 细胞呈强阳性反应( + + + ) 。，3 2 胚胎评分标准：基本按照E d w a r d
7、sR G 的原标准，即以每1个胚胎按照其形态学好坏而评定的形态学分乘以分裂球数计算胚胎评分，后者反映其分裂速度。形态学分评定标准为：4 分：分裂球大小均匀，透亮，无碎片；3 分：分裂球大小基本均匀，碎片 0 0 5 ，t 检验) ，而对照组平均年龄较不孕症组轻( P 0 0 5 ) 见表2 、3表1 患者的临床信息与妊娠的关系表2 不同表达程度的整合素B3 砸基患者I V F E T 妊娠率表3 妊娠组、非妊娠组及对照组整合素B3 亚基表达3 统计不孕症类型中发现3 3 例患者其中1 7 例为继发不孕，1 6例为原发不孕。妊娠组的7 例均为继发不孕患者，原发病例无一例妊娠成功。两组差异显著(
8、P 5 0 、2 0 5 0 和 2 0 ) 。又根据其形态随时间的变化划分为三个发育阶段，分别为：发育中( d e v e l o p i n g ) 、充分发育( f u l l yd e v e l o p e d ) 、衰J 区( r e g r e s s i o n ) 。发育中p p 的特征形态为光滑的、薄弱的质膜突起，呈现在整个细胞尖端；发育完全的p p 呈现出“花样”的肿胀的质膜状态，而且认为它的出现标志着子宫内膜的最佳容受期。衰退期的p p 表面开始出现褶皱，并且部分已逐渐被一些微绒毛取代【3 J 。p p 这一系列的形态学变化出现在短短的两天之内。因此推断人类胚胎的着床期
9、有可能非常短暂。通过对不同人群的研究发现，平均来说，p p 出现于自然月经周期的第2 0 一2 1 天；促排卵周期的第1 9- - 2 0 天。但其具体表达时间还存在个体差异5 1 。N i k a s 通过对1 7 名接受I V F 而行促排卵的妇女的内膜进行活检，以7 名具正常月经周期者作对照，发现p i n o p o d e 的出现时间在不同个体问最多相差5 天，具体结果如下：促排组：D a y l8 ( n = 2 ) ；D a y l9 ( n = 7 ) ；D a y 2 0 ( n = 4 ) ；D a y 21( n = 3 ) ；D a y 2 2 ( n = 1 ) 。对
10、照组：D a y 2 0 ( n = 2 ) ；D a y 2 1 ( n = 2 ) ；D a y 2 2 ( n 2 3 ) 。据此推测人类胚胎的着床期可能是不连续的们。后来又发现p p 的表达受孕激素的严格调控。当体内孕酮水平逐渐升高到一个较高的浓度时，内膜上的p p 开始出现。而孕酮浓度的降低也就恰恰标志着p p 的衰退。人体内最大的孕酮浓度出现在L H 峰后的6 7 天，而p p 就在这一时期出现，同时也发现孕酮受体一B 的降调节与p p 的发育同步【”。这几点与上面提到的促排卵周期时p p 的表达提前都恰恰表示p p 受体内、外孕激素的严格调控。通过电镜观察到，孕酮改变的只是p p
11、 出现的时间而并未1 q 改变其形态及生存期限。B e n t i n 等人的研究也发现p p 出现在排卵后的68 天，与正常月经周期相比，促排卵周期的表达提前l 一2 天，而在激素替代的人工周期则拖后，其结论与N i k a s 大体相同。同时他们通过体外实验发现胚胎更倾向于着床在p p 大量表达的内膜区域，但运用透射电子显微镜进一步发现，胚胎并非黏附在p p 表达的内膜细胞顶端，而是通过尖端复合连接体( a p i c a lj u n c t i o n a lc o m p l e x e s ) 与这些细胞的侧面质膜发生连接。这一超微结构的发现表明p p 可能不直接参与胚胎与内膜间的
12、相互作用 8 】。但也有学者通过研究发现p p 的生存时间并非只有两天，而是在整个黄体期均有表达，并认为着床窗并非是一个短暂的时期 4 ，可见在这一点上还存在争议。还需要进一步研究证实。但无疑p p 可以作为一种较好的子宫内膜容受期的形态学标记物，并有望用于指导临床。2 子宫内膜分子生物学评价标准除了上述提到的形态学标记，随着分子技术及免疫组化技术的运用，现己发现了许多小分子蛋白在指导胚胎着床方面起到了重要作用。它们中的一些表达在子宫内膜上皮细胞表面，在受精卵定位及黏附于子宫内膜时起着重要作用。另一些被认为存在于细胞外基质中，在受精卵的侵入过程中发挥作用。现在有许多的生物小分子物质被提出可以作
13、为子宫内膜容受性的标记，在这里，我们主要综述受生殖医学界广泛重视并且也是研究较多，对指导临床较有意义的一类膜受体家族一整合素( i n t e g r i n ) 。整合素是一类细胞外基质糖蛋白，属于黏附分子超家族，由Q 、B 亚单位组成的异源二聚体，通过识别配体中的精氨酸。甘氨酸一天冬氨酸( A r g G l y A s p ，R G D ) 序列，介导细胞之间及细胞与细胞外基质之间的黏附和信息传导。研究发现，在正常月经周期中，整合素在子宫内膜上皮细胞表面呈现时间及空间上的特异性表达，其中三种整合素( o ，1 3 ，、Q ，p 。和、。p ，) 共同表达在胚胎着床窗口期( L H 峰值后
14、的7 9 天) ，被认为在胚胎移植中起重要作用。而现在研究最多的是Q 。口；。L e s s e y 等人在9 0 年代初就开始了对整合素的进行研究。他们主要通过提取L H 峰后7 9 天的子宫内膜，然后采用免疫组化的方法对其进，n 行蛋白印迹( W e s t e r nB l o t ) 然后用H S C O R E 值对其表达强度及分布进行半定量分析。发现整合素亚单位B ，表达于黄体中期以后( 即正常月经周期第1 9 天以后) 的子宫内膜及早孕蜕膜中，与子宫内膜“植入窗”的开放同步。近几年来，对整合素研究的重点主要是它与各种不孕症之间的关系和利用它来评价I V F 妊娠结局的意义阳儿“”
15、。L e s s e y 等人近十年来的研究发现，在因胚胎着床失败而导致不孕的患者子宫内膜中均存在着整合素的表达异常。这些病因包括黄体功能不全、子宫内膜异位症、输卵管积水及不明原因不孕等。T h o m a s 等人通过对6 6 名接受I V F 前、后行Q 。Bs 的检测，评价其表达量与妊娠结局的关系中发现，经I V F 后妊娠的妇女子宫内膜Q ，B 。表达量显著高于非妊娠组，而且a ，B 。阳性表达组的妊娠率为4 7 显著高于E n g m a n n 最近统计的两个I V F 周期后的平均妊娠率3 8 。但在本次研究中也发现在阴性表达的1 5 例中也存在4 例妊娠成功者这一点T h m
16、a s 解释为有可能胚胎植入后产生的某种生物学信息导致a ，ps 表达的上调，而在此次试验中并未考虑胚胎因素。而且各种超促排卵方案很可能导致a 。B 。的异常表达，而这种异常表达存在着个体差异“。总之，大量研究表明整合素中的a 。B 。的存在标志着子宫内膜对胚胎的良好接受性。对于临床上指导I V F 结局方面有重要指导意义。并且假设：可否通过对那些，B 。异常表达个体在I V F 前提高内膜d ，。的表达量，从而得到更满意的妊娠结局。但是现在认为这种生物标记物在临床应用方面还存在着缺陷，因为人们还无法肯定整合素的表达是否在每个月经周期中都相同。即：只进行一个周期的a ，B ；检测能否正确评价每个周期的内膜容受性? 。因此学者们认为在利用它作为评价I V F 的妊娠成功率时应考虑其他因素并结合其他内膜容受性的标记物。另外研究比较多的分子生物学标记物还有：白血病抑制因子( L I F ) ；白细胞介素I 的I 型
