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1、兰塑苎查兰旦查垦兰堕一三生兰堂堕墨中英文缩略词表序号英文缩写英文全称中文名称1D S BD o u b l es t r a n db r e a k双链断裂2S S B35 一m C4C p G5C p G s6T M7R A S S F l A8E c a d h e r i n9P C R1 0B S P1 1B i P S1 2M S P1 3C o B R A1 4D HP L CS i n g l es t r a n db r e a k单链断裂5 - m e t h y l a t i o nc y t o s i n e5 - 甲基胞嘧啶T h ec y t o s i n
2、ea n dg u a n i n ed i n u c l e o t i d eC G 二核苷酸C p Gi s l a n d sT u m o t l rM a r k e r sR A Sa s s o c i a t i o nd o m a i nf a m i l yg e n elAE p i t h e l i a lc a d h e r i ng e n eP o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nB i s u l f i t es e q u e n c i n gB i s u l f l t e - P C R - S
3、 S C PM e t h y l a t i o ns p e c i a lP C RC o m b i n e db i s u l f i t er e s t r i c t i o na n a l y s i sC p G 岛肿瘤标志物R A S 相关结构域家族基因1 A上皮钙粘附蛋白基因聚合酶链反应亚硫酸氢钠测序法亚硫酸盐- P C R - S S C P甲基化特异性聚合酶链反应限制性内切酶分析法D e n a t u r eh i g h p e r f o r m a n c el i q u i d 变性高效液相色谱c h r o m a t o g r a p h y1
4、5M s - S n u P EM e t h y l a t i o ns e n s i t i v es i n g l en u c l e o t i d e1 6N a H S O ，1 7T S G s1 8S N P s1 9L M P C R2 0S A G E2 lC l A P2 2D M Sp r i m e re x t e n s i o nB i s u l f i t es o d i u mT u m o u rs u p p r e s s o rg e n eS i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i
5、 s m sL i g a t i o n - m e d i a t e dP C RS e r i a la n a l y s i so f g e n ee x p r e s s i o nA l k a l i n ep h o s p h a t a s ec a l fi n t e s t i n eD i m e t h y l s u l f a t e甲基化敏感的单核营酸引物延伸亚硫酸氢钠抑癌基因单核苷酸多态性连接介导聚合酶链式反应基因系列表达分析碱性磷酸酶硫酸二甲酯华中科技大学同济医学院硕士学位论文D N A 修饰及其检测方法研究硕士研究生：张莉君指导老师：徐顺清教授
6、中文摘要D N A 是生命的物质基础，编码着自然界千变万化的遗传现象，贮存着生物界无穷无尽的遗传信息。众所周知，D N A 分子由A 、T 、c 、G 四种核苷酸经3 ，5 磷酸二酯键相连构成D N A 的基本骨架。但在基本骨架之外，D N A 还存在修饰，构成对D N A 结构的重要补充，其中同样蕴涵神秘的遗传学信息。D N A 修饰( D N Am o d i f i c a t i o n ) 是指与D N A 共价结合的修饰基团，其结果是使具有相同序列的等位基因处于不同的修饰状态，其分子基础是D N A 甲基化以及染色质的化学修饰和物理重塑。D N A 修饰与蛋白修饰、非编码R N A
7、 调控共同构成了表观遗传中基因表达调控的3 个层面，共同在遗传因素和环境因素的互动关系中起着桥梁的作用。D N A 修饰按来源主要分为两大类：D N A 自发性化学修饰和外来因素引发的修饰。“D N A 甲基化限制修饰系统”是最常见的D N A 自发性化学修饰，也是D N A修饰研究领域的第一项重大发现。D N A 甲基化可能存在于所有生物中，在真核生物基因组中主要发生在C p G 和C p X p G 的胞嘧啶碱基5 位碳环上，简称5 - m C ，原核生物基因组中C C A T G G 和G A T C 则常被甲基化。D N A 甲基化是表观遗传学中研究最为深入的一种形式，具有多方面的生物
8、学意义，与胚胎正常发育、基因表达调控、雌性个体x 染色体失活、寄生D N A 序列的抑制、印迹基因及基因组的结构稳定等关系密切。特别是近几年研究发现，该机制的异化可导致基因表达的异常及基因组稳定性的降低，继而促进肿瘤发生和发展。2华中科技犬学同济医学院硕士学位论文除了D N A 自发性化学修饰，外环境中的理化因素也能作用于细胞内D N A ，对D N A 的结构和稳定性产生影响，导致碱基修饰和加合物形成，这就是另一类D N A 修饰。若这些D N A 分子上的修饰逃脱了生物体内的修复或被不正确的修复，则将导致遗传信息的改变而诱发变异。所以，D N A 加合物的形成可能是产生D N A突变的第一
9、阶段，继而发生D N A 链断裂、碱基置换和碱基缺失等一系列事件。很多研究已经证明，环境中多种诱变剂或其活性产物能与D N A 结合形成加合物，引发D N A 损伤或基因结构的异常，由此造成的重要相关基因表达或功能上的改变是细胞恶性转化的主要前提。随着现代分子生物学技术和理论的发展，人们正在不断的发展并完善灵敏的技术来检测化学物与D N A 的作用，以使D N A 甲基化、D N A 加合物及D N A 双链断裂( D o u b l eS t r a n dB r e a k ，D S B ) 等D N A 分子异常修饰与疾病发生和遗传变异的关系更明朗的展现在人类面前。本研究的目的是建立D
10、N A 甲基化和D N A 加合物这两种D N A 修饰的检测方法。在第一部分中，我们用亚硫酸氢钠测序法成功鉴定了人肿瘤细胞株H e p G 2和M C F 一7 的R A S S F lA 和E c a d h e r i n 基因启动子甲基化状态，同时，针对亚硫酸氢钠处理后的D N A 进行P C R 扩增出现大量非特异性扩增产物，扩增效率很低等缺点，对原有方法中的P C R 扩增方法加以改进，使之更有利于D N A 甲基化的检测，也为P C R 扩增C G 含量较高的启动子区域提供了参考方法。另外，已知的加合物检测方法仅能检测特定基因片段中的D N A 加合物，对全基因组结合物尚无法达到
11、检测的目的，鉴于此，我们建立了一种检测基因组中D N A 加合物的新方法，实验证实该方法合理可行，有望成为一种高通量且快速有效地检测基因组D N A 加合物位点的新技术。第一部分改进的亚硫酸氢钠测序法在启动子C p G 岛甲基化检测中的应用目的：用亚硫酸氢钠测序法检测启动子C p O 岛甲基化状态，改进其P C R 扩增过程，并检验改进后方法在甲基化检测中的可行性。方法：人肿瘤细胞株H e p 0 2和M C F - 7 基因组D N A 经亚硫酸氢钠化学修饰后；针对R A S S F l A 和E c a d h e r i n华中科技大学同济医学院硕士学位论文基因启动子D N A 序列分别
12、设计特异性引物，用常规、降落、及改进P C R 分别扩增，比较扩增效果，P C R 产物纯化回收后，T - A 克隆入载体p G E M T ，转化大肠杆菌f Ec o l iD H 5C 1 ) ，经P C R 扩增鉴定后获得阳性克隆，测序比对。结果：H e p G 2细胞中R A S S F I A 基因启动子扩增产物直接测序结果显示，所测3 6 5 个碱基对应的原始序列中含胞嘧啶( c ) 1 1 3 个，其中1 5 个C G 位点均未转变，m C p G C I z I G为1 0 0 ，序列起始部位还有4 个C 未转变，其余9 4 个c 全部转变为T ，转化率为9 5 9 2 ，实验
13、结果再次证明H e p G 2 细胞R A S S F l A 基因启动子是高甲基化的，同时证明亚硫酸氢钠化学修饰完全、结果可信。M C F 一7 细胞扩增产物克隆测序显示，R A S S F l A 基因启动子1 7 个C G 中有1 6 个C O 未转变为T G ，m C p G C p G 为9 4 2 ，其余还有3 个C T G 和1 个C A G 未转变；E 。c a d h e r i n 基因启动子共有3 7个C G ，其中有3 2 个转变为T G ，其余5 个保持C G 不变，m C p G C p G 为1 3 5 ，其余碱基中还有3 个C T G 和3 个C A G 未转变
14、为T T G 和T A G 。比较三种P C R 扩增效果，发现用改进后的P C R 可可扩增出理想目的条带，用降落P C R 和常规P C R方法，也有目的条带出现，但亮度明显减弱，且引物二聚体和非特异性扩增产物明显。结论：H e p G 2 细胞基因组D N A 中R A S S F l 一A 启动子是高甲基化的；M C F 一7 细胞基因组D N A 中，R A S S F l A 基因启动子C p G 岛是高甲基化的，而E c a d h e r i n 基因启动子C p G 岛未呈现高甲基化状态；改进后的P C R 与常规、降落P C R 相比，提高了扩增效率，抑制了非特异性扩增，增
15、强了以P C R 为基础的甲基化分析的可行性，更为扩增C O 含量较高的启动子区域提供了参考。第二部分用L M P C R 检测基因组D N A 加合物的方法学研究目的：基于L M P C R 技术，建立一种检测基因组加合物的新方法。方法：盐酸氮芥处理人肝瘤H e p G 2 细胞形成的加合物，制备基因组D N A 片段、L M P C R检测。具体策略如下：首先，提取基因组D N A 经X b a I 内切酶切割，得到的D N A片段与人工合成的连接子L i n k e r 3 连接，P C R 检测连接效果。其次，上述连接产物经碱性磷酸酶( C I A P ) 去磷酸化处理消除已有磷酸末端
16、，处理产物经哌啶剪切及变性后，在加合物位点处断裂形成带有5 磷酸基末端的D N A 单链。再用单个引物P r i m e r 3 在T a q 酶的作用下将D N A 单链延伸成带有A 尾的粘端双链结构。再次，粘端双链经T 4D N A 连接酶与5 端为T 、带有磷酸基团的连接子L i n k e r l华中科技大学同济医学院硕士学位论文连接，亲和素包裹的磁珠捕获连接产物。以该连接产物为模板，生物素标记P r i m e r l和P r i m e r 3 为引物扩增。最厉，P C R 产物绛磁珠纯化、M i n eI 内切酶切割后与人工合成的连接子L i n k e r 2 连接，以该连接产物为模板，P r i m e r l 、P r i m e r 2 为引物扩增包含有加合物相邻基因的D N A 片段。结果：盐酸氮芥给药浓度与H e p G 2细胞存活率呈负相关( R 2 = O 9 5 7 ，P 0 0 1 ) ，依照标准曲线，确定H e p G 2 存活率为9 0 的盐酸氮芥处理浓度为O 4 5 m m o
