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1、 1二维柱切换二维柱切换 LC-MSMS 联用法测定奶粉中维生素联用法测定奶粉中维生素ADE 的含量的含量 Dionex 中国有限公司应用研究中心上海实验室 检测项目 维生素 A,E 和 D3, 仪器型号 Ultimate DGP 3600 UHPLC+系列: DGP-3600SD WPS 3000TSL TCC-3200（配置一个六通阀和 online SPE 的 Viper Kit） DAD-3000 TSQ vantage 方法开发 张艳海，曾明飞 审核人 金燕 时 间 2012.09.17 2012. 9. 21 1 引引 言言 配方奶粉又称为母乳化奶粉，是一种以牛乳（或其他动物乳）为
2、主要原料，通过调整成分模拟母乳， 可供婴幼儿生长和发育所需要的一种人工食品。 根据国家标准中奶粉营养成分有关规定， 维生素指标中必须强化的包括维生素A、 维生素D和维生素E及其他水溶性维生素等。HPLC法是常用的分析方法，文献报道较多，但由于奶粉基质复杂，且三种维生素对温度、光照、氧气和极端的pH值较敏感。标准分析方法常包括皂化、有机溶剂萃取，浓缩和净化等步骤，尤其在国标分析方法中需采用正相色谱、反相色谱两套仪器，分别进行净化和分析；一个样品要分成三次进样才能完成全部分析过程，前处理过程极其繁琐，大大影响样品分析效率。前期实验本文利用双三元液相色谱-二维柱切换技术建立了HPLC-UV检测的分析
3、方法，本文拟在前期方法UV检测基础上串联质谱，以增加维生素D的检测灵敏度。 2 样品前处理样品前处理 精密称取奶粉 10 g，于 150 mL 锥形瓶中，加入 30mL 热水使溶解，再加入 15g/L 的维生素 C 乙醇溶液 100mL，再加入 100%氢氧化钾溶液 25mL，磁力搅拌 30 分钟，温度 60 度。 将皂化液转移至 500mL 分液漏斗中，以石油醚萃取 3 次，每次 100mL，合并萃取液，萃取液以水洗涤 35 次，至中性（pH 试纸测试） ，收集石油醚层，经过无水硫酸钠脱水。低温减压回收石油醚，至 12mL 时转移至 10mL 棕色瓶中，氮气吹干，再以 35mL 甲醇使溶解并
4、转移至 10mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，待用。未用完溶液放入 4 C 冰箱保存。 3 色谱条件及标样色谱图色谱条件及标样色谱图 一维分析柱 Acclaim C18，120A ，3*150mm*3m，S/N 001120，P/N: 063691 二维分析柱 Acclaim Polar AdvantageC18 120A 4.6*150mm*3m，S/N 001180，P/N: 063191 柱 温 30 C 2流动相 A 乙腈 流动相 B 富集泵：甲醇 分析泵：异丙醇 流动相 C 富集泵：甲醇：四氢呋喃=80：20 流速 0.8 mL/min for 分析泵；0.6 mL/min for
5、 富集泵 检 测 UV263nm 进样量 50 L 梯度及阀切换 表 1 富集泵梯度及阀切换时间 时间 （min） A% B% C% 阀切换时间 阀 0 60 40 0 0 1-2 15 60 40 0 7.6 6-1 15.1 0 0 100 8.6 1-2 25 0 0 100 25.1 60 40 0 30 60 40 0 表 2 分析泵梯度 时间 （min）A% B% C% 0 100 0 0 9 100 0 0 25 80 20 0 28 80 20 0 28.1 100 0 0 30 100 100 0 双梯度泵系统净化泵分析泵自动进样器净 化 柱54321 6Inject val
6、ve分析柱UV 废液上样，净化转移TSQ 图 1 柱切换方法分析维生素 D 质谱条件 APCI 源： 正离子扫描模式， Discharge Current： 6A， Vaporizer Temperature300；Sheath Gas Pressure：30psi，Capillary Temperature：300，4、结果与讨论、结果与讨论 34.1 质谱分析参数质谱分析参数 本文对比了 ESI 源和 APCI 源，在给定的色谱条件下，APCI 源的离子强度高于 ESI 源，正离子扫描优于负离子扫描。质谱分析参数见表 3.。维生素 ADE 的结构式见图 1.。 CH3CH3H3CCH3CH
7、2HOHVitamin D3 Vitamin A Vitamin E 图 1 维生素 D3、维生素 A 和 E 的结构式 表 3 质谱分析参数 待测组分 保留时间 Min SRM Coll. energy Parent ionProduct ion 维生素 A 2.55 269.1 213.10 12 105.10 31 91.0 37 维生素D3 22.07 385.2 367.2 10 107.03 26 105.03 36 91.04 44 维生素 E 9.64 431.1 342.9 17 4165.0 25 73.0 35 4.2 标准品谱图标准品谱图 RT: 0.00 - 30.0
8、0024681012141618202224262830Time (min)05101520253035404550556065707580859095100Relative AbundanceVitamin E-9.6410.2311.5425.3015.2320.3317.7516.4913.3528.6223.1027.4826.3021.4118.3924.339.218.496.474.427.496.013.560.531.162.56Vitamin A -2.503.572.144.191.506.094.937.2410.177.7511.989.2715.6022.6914.
9、7618.8512.7817.7619.6329.0924.6717.0828.1220.5627.0325.1923.17Vitamin D2-21.0924.7318.9424.5524.9219.0129.1022.1828.418.8920.7713.440.977.7911.796.979.414.9110.2514.871.805.7218.0827.663.3923.5214.982.3726.8217.10Vitamin D3- 22.0719.6824.6525.0529.1328.138.2114.835.4622.6211.0511.582.613.959.366.471
10、4.3626.870.289.857.461.9220.6618.0916.74NL: 2.39E7TIC F: + p APCI SRM ms2 431.100 72.750-73.250, 164.750-165.250, 342.650-343.150 MS c3-a&e_120921123605NL: 1.30E6TIC F: + c APCI SRM ms2 269.100 90.750-91.250, 104.850-105.350, 212.850-213.350 MS c3-a&e_120921123605NL: 2.47E3TIC F: + c APCI SRM ms2 39
11、7.287 90.750-91.250, 104.850-105.350, 379.050-379.550 MS c7-d_120922003958NL: 3.26E4TIC F: + c APCI SRM ms2 385.200 90.790-91.290, 104.780-105.280, 106.810-107.310, 367.030-367.530 MS c7-d_120922003958图 2 混合标准品谱图 4.3 样品分析谱图样品分析谱图 RT:0.00 - 30.00024681012141618202224262830 Time (min)01020304050607080
12、901000102030405060708090100Relative AbundanceVitamin A-RT: 2.5110.98 11.914.129.251.843.634.898.777.886.059.7612.841.0114.9214.3716.3818.9817.9419.9923.9525.5621.4723.0027.8629.4726.33 Vitamin E-RT: 9.518.32 6.849.046.4512.8812.3910.3113.43 14.50 15.367.395.2316.47 17.414.7318.37 19.66 20.61 21.56 2
13、2.60 23.79 24.4727.6925.34 26.4829.633.922.881.931.46NL: 6.45E6 TIC F: + c APCI SRM ms2 269.100 90.750-91.250, 104.850-105.350, 212.850-213.350 MS ICIS YiLi-A&E_120920140859NL: 7.10E8 TIC F: + p APCI SRM ms2 431.100 72.750-73.250, 164.750-165.250, 342.650-343.150 MS ICIS YiLi-A&E_120920140859A 5RT:
14、0.00 - 30.00024681012141618202224262830 Time (min)01020304050607080901000102030405060708090100Relative AbundanceVitamin A-RT: 2.50RT: 11.89RT: 10.14RT: 1.69RT: 9.26RT: 3.59 Vitamin E-9.539.068.326.856.475.287.7912.9612.4610.2113.434.5114.71 15.51 16.68 17.6018.82 19.50 20.60 21.964.0624.3922.5827.04
15、25.3528.693.011.460.49NL: 4.99E6TIC F: + c APCI SRM ms2 269.100 90.750-91.250, 104.850-105.350, 212.850-213.350 MS ICIS GuangMing- A&E_120920144324NL: 4.65E8TIC F: + p APCI SRM ms2 431.100 72.750-73.250, 164.750-165.250, 342.650-343.150 MS GuangMing- A&E_120920144324B RT: 0.00 - 30.00024681012141618
16、202224262830 Time (min)01020304050607080901000102030405060708090100Relative AbundanceVitamin D3-22.1224.9019.7420.5916.4814.8814.1711.336.479.43 10.723.494.4912.570.542.947.821.755.4018.7227.3824.1516.6822.7425.4329.10 Vitamin D3-22.1124.8819.7527.00 26.8827.4623.83 27.8426.3516.4623.109.1310.971.94 2.384.799.788.343.2611.567.851.191
