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1、中国医科大学研究生学位论文独创性声团Y 18 9 3 4 16| I f | I f I f I f 删| I | f l J f I I 舢l I | f I f I I | | l l l I本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其它人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：篮匣玺日期：礁2 f ：羔：丝
2、中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其它手段保存论文。论文作者签名：塑立玺指导教师签名：互益益日期：型! L ：生目录一、摘要中文论著摘要1英文论著摘要6二、英文缩略语1 1三、论文论文一1 2氤f 言1
3、2刖舌实验材料和方法1 3实验结果1 6讨论1 8结论2 0论文二2 1肓仃言2 1日I J 舌z l实验材料和方法2 2实验结果2 5讨论3 1结 仑3 5四、本研究创新性的自我评价3 6五、参考文献3 7六、附录综述4 3在学期间科研成绩5 4致谢5 5个人简介5 6中文论著摘要丙戊酸钠抑制A p 老年斑形成和t a u 蛋白磷酸化的分子生物学机制刖吾阿尔茨海默病( A l z h e i m e r Sd i s e a s e ，A D ) 是一种以进行性痴呆为主要特征的神经退行性疾病，其主要临床表现为进行性记忆力减退、认知功能下降和严重的精神障碍。老年斑( s e n i l ep
4、l a q u e ，s P ) 、神经原纤维缠结( n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s ，N F T s ) 和神经元缺失为其主要病理特征。S P 主要出现在大脑皮质和海马区域，其核心成分是一种由3 9 4 3 个氨基酸残基构成的小神经肽A p ( a m y l o i db e t ap e p t i d e ，A 1 3 ) ，A p 由淀粉样I j 体蛋白( a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n ，A P P ) 等经过p - 分泌酶及丫一分泌酶水解产生并分泌至细胞外。在正常生理状态
5、下，人脑内存在极少量( 纳摩尔级浓度) 的可溶性A p ，对神经元具有神经营养作用。但在A D 时，A P P 经过异常剪切加工形成大量A p ，且A p 从可溶状态转变为不溶状态，最终在脑部形成淀粉样沉积，是A D 发病机制中的关键环节。T a u 蛋白是一种微管相关蛋白，能与成熟神经元的微管结合，起到促进微管形成和稳定微管结构的作用。T a u 蛋白磷酸化对其与微管的结合至关重要。然而，异常的t a u 蛋白聚合成双股螺旋丝( p a r i e dh e l i c a lf i l a m e n t s ，P H F s ) ，不利于其与微管结合，并导致微管网络不稳定和神经元死亡。N
6、 F T s 的形成与t a u 蛋白过度磷酸化密切相关，且N F T s 的数量与患者的痴呆程度呈正相关。蛋白激酶( 如G S K 3 、C D K 5和M A P K ) 在t a u 蛋白磷酸化过程中起重要作用。丙戊酸钠( v a l p r o a t e ，V P A ) 是一种广泛用于治疗癫痫和情感障碍的抗惊厥药物和情绪稳定剂。最近的研究显示，V P A 也是一种预防和治疗A D 的潜在药物。V P A 通过抑制G S K 3 1 3 介导的A P P 的丫位点剪切减少了A D 转基因小鼠A D 产生和s P 的形成，改善学习记忆损伤。但是，V P A 是否影响t a u 蛋白磷酸
7、化及其潜在的机制尚不清楚。本研究首先给予A P P P S l 转基因小鼠V P A 治疗后，检测S P 形成、A B 分泌情况、A P P 的代谢和对t a u 蛋白磷酸化过程的作用途径及作用效果，进而探讨V P A对A D 小鼠脑组织S P 和N F T s 形成的影响，为探讨A D 的发病机制、寻找治疗A D 的有效药物提供理论依据。此外，本研究通过检测V P A 对冈F f l 酸( o k a d a i ca c i d ，O A ) 刺激引起的S H 。S Y 5 Y 细胞t a u 蛋白磷酸化的影响及相关蛋白激酶的变化，进一步在细胞水平探讨V P A 在A D 中的神经保护作用
8、及其机制。实验材料和方法A P P P S l ( A P P s w e P S E N l d E 9 ) 转基因小鼠购自美国J a c k s o n 实验室，通过常规喂养( 2 2 2 5o C ，5 0 湿度，1 2h 光照循环) ，繁殖后经P C R 进行基因型鉴定，鉴定后的小鼠用于实验。将2 0 周龄的A P P P S l 转基因小鼠随机分为对照组和V P A治疗组。V P A 治疗组小鼠腹腔注射V P A ( 5 0m g k g ) ，每日1 次，对照组小鼠给予等量的生理盐水。1 2 周后，小鼠经麻醉处死取材，脑组织两侧半球分开，右侧脑组织于4 多聚甲醛中固定后石蜡包埋，用
9、于免疫组化分析，左侧脑组织8 0o C 低温冷冻保存，用于生化检测、免疫印迹、E L I S A 分析等。对O A 处理的S H S Y 5 Y 细胞，给予V P A 作用2 4h ，然后应用免疫荧光和免疫印迹等方法检测t a u 蛋白磷酸化及其相关信号通路蛋白的变化。实验结果一、V P A 对A P P P S l 转基因小鼠脑内A 1 3 老年斑形成的影响1 、V P A 减少A P P P S l 转基因小鼠脑内A p 沉积和S P 形成应用免疫组化技术观察各组小鼠脑内S P 的数量及大小，结果表明V P A 治疗组小鼠的大脑皮层及海马等区域出现的阳性s P 数目与对照组相比分别显著减少
10、6 0 ，斑块沉积也分别由0 5 5 降到0 2 6 、0 5 0 降到0 1 9 ，差异具有显著的统计学意义( P 0 0 5 ) 。二、V P A 对t a u 蛋白磷酸化的影响( 一) V P A 对A P P P Sl 转基因小鼠脑内t a u 蛋白磷酸化的影响l 、V P A 抑制A P P P S l 转基因小鼠脑内t a u 蛋白磷酸化应用W e s t e r nb l o t 检测A P P P S l 转基因小鼠脑内t a u 蛋白的几个重要磷酸化位点( T h r 2 0 5 、T h r 2 3 1 和S e r 3 9 6 ) 的磷酸化水平，结果显示：在两组实验小鼠脑
11、内总t a u 蛋白表达无显著差异的情况下，V P A 治疗组小鼠脑内t a u 蛋白的磷酸化程度明显低于对照组，降低幅度分别为6 5 ( T h r 2 0 5 ，P O 0 5 ) 。这些数据表明，V P A 治疗明显抑制了A P P P S l 转基因小鼠脑内C D K 5 和G S K 3 1 3 的活性。3 、V P A 对A P P P S l 转基因小鼠脑内p 3 5 2 5 蛋白表达的影响由于C D K 5 的激活需要p 3 5 的存在，p 3 5 裂解为p 2 5 可以持续激活C D K 5 ，因此，我们进一步采用W e s t e r nb l o t 检测了p 3 5 2
12、 5 的蛋白表达。结果显示p 3 5 的蛋白表达没有明显变化抄O 0 5 ) ，但未检测到p 2 5 的蛋白表达。( 二) V P A 对O A 处理的S H S Y 5 Y 细胞t a u 蛋白磷酸化的影响3l 、V P A 抑制O A 处理的S H S Y 5 Y 细胞t a u 蛋白磷酸化为了进一步在体外探讨V P A 对t a u 蛋白磷酸化的影响，我们用O A 处理S H S Y 5 Y 细胞以诱导t a u 蛋白磷酸化，然后给予V P A 作用2 4h ，观察V P A 对培养细胞的t a u 蛋白磷酸化水平的影响。定量分析表明，与对照组相比，V P A 处理组与对照组细胞总t a
13、 u 蛋白的含量没有明显变化，而V P A 处理组细胞的t a u 磷酸化水平分别降低4 0 ( T h r 2 0 5 ，P 0 0 5 ) W ef u r t h e rt e s t e dt h ec h a n g e so fA P Pm e t a b o l i s m S t a t i s t i c a la n a l y s i ss h o w e dt h a t ，c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l ，V P At r e a t m e n ts i g n i f i c a n t l yr e d u c
14、e dt h ee x p r e s s i o no fB A C E1b y1 1 ( 西O 0 5 ) ，b u td i dn o ta l t e rt h ep r o t e i nl e v e lo fA D A M10a n dP S1i nt h eb a i no fA P P P S1m i c e6 0 0 0 5 ) 2 T h ee f f e c to fV P Ao nt a up h o s p h o r y l a t i o ni nt h eb r a i no fA P P P S1m i c e( 1 ) V P Ai n h i b i t st h et a up h o s p h o r y l a t i o ni nt h eb r a i no f A P P P S1m i c eB r a i ns a m p l e sf r o mV P A - t r e a t e dm i c ew e r es u b j e c t e dt oW e s t e r nb l o ta n a l y s i su s i n ga n t i b o d i e sa g a i n s tt o t a lt a ua n dd i f f e r e n tp h o s p
