DPRNApreppure微量RNA提取试剂盒

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1、 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD. Order: 010-59822688 Technical: 010-59822661/2665 Toll-free: 800-990-6057 RNAprep pure Micro Kit RNAprep pure 微量样品总微量样品总 RNA 提取试剂盒提取试剂盒 （离心柱型）（离心柱型） 目录号：目录号：DP420 试剂盒内容：试剂盒内容： 试剂盒组成试剂盒组成 DP420 (50 次次) 裂解液 RL 30 ml 去蛋白液 RW1 40 ml 漂洗液 RW 15 ml Carrier RNA 310 g DNas

2、e I （1500 U） 1 支 缓冲液 RDD 4 ml RNase-free ddH2O（管装） 1 ml RNase-free ddH2O（瓶装） 215 ml RNase-free 吸附柱 CR1 50 个 RNase-free 离心管（1.5 ml） 50 个 RNase-free 收集管（2 ml） 50 个 说明书 1 份 选配成分：选配成分： 蛋白酶 K（目录号：RT403） ；研磨杵（目录号：HC205） ； 过滤柱 CS： （目录号：RK124） 储存条件：储存条件： 本试剂盒在室温(15-25)条件下运输，收到试剂盒后，请立即将 RNase-free DNase I, 缓

3、冲液 RDD 和 RNase-free ddH2O 置于 2-8保存，其他试剂可置于室温保存。 1 16 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。12. 将吸附柱 CR1 放入一个新的 RNase-free 离心管（本试剂盒中已经备有）中，向膜中央加入 14 l RNase-free ddH2O，轻柔地盖上管盖，室温放置 2 分钟。12,000 rpm (13,400g )离心 1 分钟，所得溶液即为 RNA 溶液。 注意：洗脱体积不得少于注意：洗脱体积不得少于 10 l，可用减小洗脱体积的方法得到较高浓度的，可用减小洗脱体积的方法得到较高浓度的 RNA，但是这将影响总

4、的，但是这将影响总的 RNA 得率。得率。 版本号版本号: RP091105 产品简介：产品简介： 本产品采用全新技术从微量的组织和细胞中（少至 10 个细胞）进行 RNA 提取，本产品在裂解液中添加了特殊组分， 可大幅度提高 RNA 和硅基质膜的选择性结合能力。同时，在 RNA 提取过程中，还加入 RNase-free DNase I，可完全去除痕量 DNA杂质，而 RNase-free DNase I 和其他残留的物质会在随后的漂洗过程中去除，从而有效地保证了提取 RNA 的得率和纯度。 与其它提取 RNA 的普通方法相比，微量样品 RNA 提取试剂盒将所有200bp 的 RNA则被富集、

5、分离和纯化。 在本说明书中，对于不同的样品有不同的操作步骤，这些步骤的区别主要在于样品的裂解和结合至硅基质膜的条件不同，当 RNA 结合至硅基质膜后，后续步骤基本类似。 注意事项：注意事项： 1. 自备试剂与耗材：自备试剂与耗材：-巯基乙醇，无水乙醇，巯基乙醇，无水乙醇，1.5 ml RNase-free 离心管离心管 2. 样品使用量的确定：样品使用量的确定： 为了使用本试剂盒得到高产量和高纯度的 RNA，使用样品的量是否得当是很重要的，因为吸附柱的吸附量以及裂解液的用量有一定限制，只有保证样品充分的裂解及 RNA 充分吸附在硅基质膜上，RNA 的得率才有保证。表 1 是该试剂盒的技术指标，

6、表 2 是在不同培养条件下细胞的数量。 表 1 微量样品 RNA 提取试剂盒技术指标 最大吸附能力 45 g RNA 吸附柱最大容量 700 l 提取 RNA 的长度 200 bp 最小洗脱体积 10 l 样品使用最大量（动物细胞） 5105 样品使用最大量（动物组织） 5 mg 注意：如果超出该试剂盒的最大吸附能力，注意：如果超出该试剂盒的最大吸附能力，RNA 的产量可能会降低，而如果样品未能裂解完全，的产量可能会降低，而如果样品未能裂解完全，RNA 的产量也会降低。的产量也会降低。 2 技术支持：010-59822661/2665 WWW.TIANGEN.COM 15 2. 样品的匀质化（

7、请见步骤 2a，2b） 注意：匀质不彻底将导致注意：匀质不彻底将导致 RNA 提取量低，还可能导致吸附柱提取量低，还可能导致吸附柱 CR1 堵塞，采用匀浆器或过滤柱进行匀质，会比采用其他方式匀浆获得更高的堵塞，采用匀浆器或过滤柱进行匀质，会比采用其他方式匀浆获得更高的 RNA 得率。得率。 2a 将加入裂解液的细胞转移至过滤柱 CS（客户自备，订购信息见第 1 页）上(过滤柱过滤柱 CS 放在收集管中放在收集管中)，12,000 rpm (13,400g )离心 2 分钟，收集滤液，继续步骤，收集滤液，继续步骤 3。 2b 使用匀浆器匀浆 30 秒。 3. 加入 1 倍体积（通常为 350 l

8、）70%乙醇，用移液器混匀，立即进行第 4 步。 注意：如果在匀质的过程中损失了一些裂解液，注意：如果在匀质的过程中损失了一些裂解液，70%乙醇的加量也要相应减小。如果在第乙醇的加量也要相应减小。如果在第 2 步中只加入了步中只加入了 75 l 的裂解液的裂解液 RL，则在本步骤中也只需加入，则在本步骤中也只需加入 75 l的的 70%乙醇，加入乙醇后，溶液中可能会出现沉淀，但是不会影响乙醇，加入乙醇后，溶液中可能会出现沉淀，但是不会影响 RNA 的提取。的提取。 4. 将所有溶液及沉淀全部转移至吸附柱CR1上 （吸附柱CR1放在2 ml RNase-free的收集管中，此收集管试剂盒中已经备

9、有） ，轻柔地盖上管盖，12,000 rpm (13,400g )离心 30-60 秒，弃废液，将吸附柱 CR1 放回收集管中。 5. 向吸附柱 CR1 中加入 350 l 去蛋白液 RW1，12,000 rpm(13,400g)离心30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CR1 放回收集管中。 6. DNase I 工作液的配制：取 10 l DNase I 储存液放入新的 RNase-free 离心管中，加入 70 l RDD 溶液，轻柔混匀。 7. 向吸附柱 CR1 中央加入 80 l 的 DNase I 工作液，室温放置 15 分钟。 8. 向吸附柱 CR1 中加入 350 l

10、去蛋白液 RW1，12,000 rpm(13,400g)离心30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CR1 放回收集管中。 9. 向吸附柱 CR1 中加入 500 l 漂洗液 RW （使用前请先检查是否已加入乙醇使用前请先检查是否已加入乙醇） ， 室温静置 2 分钟， 12,000 rpm(13,400g)离心 30-60 秒， 倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CR1 放回收集管中。 10. 重复步骤 9。 11. 12,000 rpm(13,400g)离心 2 分钟，倒掉废液。将吸附柱 CR1 置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗

11、液去除，离心后将吸附柱注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱 CR1 在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的 RT 等实验。等实验。 表 2 不同培养条件下 HeLa 细胞的数量 细胞培养器皿细胞培养器皿 生长面积（生长面积（cm2） 细胞数量细胞数量 96-孔细胞培养板 0.32-0.6 4-5104 48-孔细胞培养板 1 1105 24-孔细胞培养板 2 2.5105 12-孔细胞培养板 4 5105 6-孔细胞培养板 9.5 1106 平皿（35 mm） 8 1106 摇瓶（40

12、-50 ml） 25 3106 3. 样品的储存和处理：样品的储存和处理： 组织若不经过处理，其中的 RNA 处于无保护状态，容易被降解，所以新鲜组织应及时放入液氮中速冻并立即储存于70，冻存的组织不能反复冻融以避免RNA 的降解，样品也可以在匀浆后加入裂解液 RL，储存于70，冻存的样品可稳定储存数月。 4. 样品的裂解和匀质：样品的裂解和匀质： 有效的裂解和匀质是提取 RNA 的重要步骤，裂解和匀质是两个不同的步骤。 裂解：裂解：将组织和细胞完全裂解，以彻底释放出样品中所有的 RNA，不同的样品裂解的方法不同，如果样品裂解不彻底，将导致 RNA 得率低。 匀质：匀质： 匀质的过程是为了降低

13、细胞裂解后的溶液粘度， 将高分子量的基因组 DNA和其他物质切断，形成均一的溶液，利于 RNA 与硅基质膜的结合。如果匀质过程未处理好，将影响 RNA 与硅基质膜的结合，从而导致 RNA 提取量低。匀质的方法包括匀浆、涡旋振荡、过滤柱、注射器或枪头吸取等。 5. Carrier RNA： 当处理200bp 的片段，所以如果样品中的 RNA 高度降解，可能会出现提不出 RNA 的情况。 1. 预先加热水浴至 55，为第 5 步中的蛋白酶 K（客户自备，目录号：RT403）消化做准备。 2. 向样品中加入适当体积的裂解液 RL（使用前请向（使用前请向 RL 中加入中加入 -巯基乙醇，终巯基乙醇，终

14、浓度浓度 1） ， 加入裂解液 RL 体积与微切割仪器的容积有关， 但不能超过 140 l。 3. 如果需要， 可以将样品和裂解液 RL 转移至 1.5 ml 或 2 ml 的 RNase-free 的离心管中（客户自备） 。补充裂解液 RL 至体积为 150 l。 注意：当处理的细胞量小于注意：当处理的细胞量小于 5000 时，向溶液中加入时，向溶液中加入 20 ng Carrier RNA （5 l 4 ng/l Carrier RNA 工作液） ，工作液） ，Carrier RNA 工作溶液的配制请见第工作溶液的配制请见第 4 页溶液配制说明。页溶液配制说明。 4. 向溶液中加入 295

15、 l RNase-free ddH2O，然后加入 5 l 蛋白酶 K 溶液（浓度20mg /ml，客户自备） ，用移液器混匀，55孵育 10 分钟。室温 12,000 rpm (13,400g ) 离心 3 分钟。 注意：此时的组织碎片可能会形成小球，有时在溶液上面会浮有一层薄膜。注意：此时的组织碎片可能会形成小球，有时在溶液上面会浮有一层薄膜。 5. 用移液器将上层溶液 （450 l 左右） 转移至一个新的 RNase-free 离心管中 （客户自备） 。 注意：使用移液器吸取上层溶液时，一定要避免接触到组织碎片小球，而且枪头要伸到薄膜以下进行吸取，避免将薄膜转移至离心管中。注意：使用移液器

16、吸取上层溶液时，一定要避免接触到组织碎片小球，而且枪头要伸到薄膜以下进行吸取，避免将薄膜转移至离心管中。 6. 向吸出的上层溶液中加入 0.5 倍体积的无水乙醇（通常为 225 l） ，用移液器混匀。 注意：在加入乙醇后，溶液中可能会出现沉淀，但是不会影响注意：在加入乙醇后，溶液中可能会出现沉淀，但是不会影响 RNA 的提取。的提取。 7. 将所有溶液及沉淀全部转移至吸附柱 CR1 上（吸附柱 CR1 放在 2 ml 收集管中，此收集管试剂盒已经备有） ，轻柔地盖上管盖，12,000 rpm (13,400g )离心 30-60 秒，倒掉废液，将吸附柱 CR1 放回收集管中。 5. 将所有溶液及沉淀全部转移至吸附柱 CR1 上 （吸附柱 CR1 放在 2 ml 收集管中，试剂盒中已备有） ，轻柔地盖上管盖，12,000 rpm (13,400g )离心 30-