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1、原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：吝瞎戽日期：j 弘雌关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。( 保密论
2、文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：泌翩签名：乒塑鸟期：露驯蔓山东大学硕士学位论文P T T G 、b - F G F 在子宫腺肌病组织中的表达及其与血管生成的相关性研究硕士研究生刘天风硕士生导师尹福波中文摘要目的观测子宫腺肌病患者在位内膜和异位内膜组织中垂体肿瘤转化基因( P T T G ) m R N A 及其蛋白、碱性成纤维细胞生长因子( b F G F ) 蛋白及新血管形成( 微血管密度M V D ) 的情况，探讨P T T G 在子宫腺肌病组织中的表达及其与组织中b F G F 的表达、新血管形成的相关性。方法采用原位杂交技术，检测子宫腺肌病患者在位内膜和异位内膜( 3 5 例)组
3、织中P T T G m R N A 的表达，采用免疫组化S P 方法检测P T T G 、b - F G F 蛋白的表达水平，C D 3 4 标记血管内皮并计数微血管密度( M 、D ) 。以非子宫腺肌病患者正常内膜( 1 8例) 作为对照。应用S P S S I O O 统计软件进行分析，各组之间的差异采用M a n n -w h i t n e yr a n k 检验，P T T G 、b - F G F 与M V D 的相关性采用等级相关分析。结果P T T G m R N A 在对照组正常内膜不表达或弱阳性表达，在实验组在位内膜中弱阳性表达或阳性表达，异位内膜组织中成阳性或强阳性表(
4、p 5 0 。根据阳性细胞所占比例及相应染色强度进行评分p i ( 其中i 代表细胞浆染色强度) ，i 为0 、l 、2 、3 时分别表示阴性( 即无着色细胞) 、弱阳性( u p 浅棕黄色) 、阳性( 即棕黄色) 、强阳性( H p 深棕黄色) ：p 代表同一染色强度细胞所占计数细胞百分比，l 、2 、3 、4 、5 分别表示染色细胞占计数细胞总数的0 1 5 、1 6 5 0 、5 1 8 5 、8 6 9 5 、9 6 1 0 0 。( 2 ) M V D 测定结果判断：用C D 3 4 进行血管内皮细胞的免疫组化染色，以血管内皮细胞胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性，在低倍镜下选择组织血管密度
5、最大的3 个区域，在2 0 0 倍视野范围内对微血管进行计数，取平均值作为N I V D ，任何单个的内皮细胞或成簇的内皮细胞均记为一个微血管，肌层较厚以及管腔面积大于8 个红细胞直径的血管不计。四、统计学分析应用S P S S I O 0 统计软件进行分析，各组之间的差异采用M a n n w h i t n e yr a n k 检验，P T T G 、b - F G F 与M V D 的相关性采用等级相关分析。1 2山东大学硕士学位论文结果一、P T T G 的表达l 、P T T G m R N A 在子宫内膜组织中的表达P T T G m R N A 的阳性信号主要位于腺上皮细胞胞浆
6、，大多数间质细胞未见明显表达。正常内膜、在位内膜与异位内膜组织中的表达阳性率分别为5 1 8 ，2 6 3 5 ，3 1 3 5 ，P T T G 异位内膜和在位内膜组织中表达阳性率显著高于正常内膜( p 均在位内膜 正常内膜的情况。说明异位内膜中B c l 一2 表达最强，细胞凋亡减少可能在子宫腺肌病的发病中起重要作用。关于B c l 一2 在问质中的表达情况亦报道不一。J o n e s 等嘲研究发现间质 B c l 一2 表达，在正常子宫内膜和子宫腺肌病的在位子宫内膜中的表达呈现周期性，于分泌晚期升高。在子宫腺肌病的异位内膜的问质中有阳性表达但失去周期性。尽管各位学者针对B c i -
7、2 在子宫腺肌病中表达的研究结果不完全相同，但总的观点均为：B c l - 2 的表达使凋亡减少，增殖增加，有利于促进子宫腺肌病的发生。G o u m e n o u等o ”研究T B a x 在子宫腺肌病异位内膜组织中的表达情况，证实其表达不随卵巢功能而发生周期性变化。并且同时证实了B a x 与B c l - 2 之间存在着较强的负相关。因此，说明当B c l 一2 表达增强时，B a x 表达减弱，结果使细胞凋亡平衡遭到破坏，细胞凋亡减少，增殖增强，最终导致子宫腺肌病的发生。M a t s u m o t o 等1 用免疫组化法测定了子宫腺肌病异位内膜组织中K i _ 6 7 的表达情况
8、。K i - 6 7 在异位内膜腺上皮中呈现持续性表达，即不随月经周期而发生改变。而在位内膜中K i - 6 7 于分泌期表达明显减少。异位内膜不受此影响。K i - 6 7 在异位内膜中的异常表达有利于促进1 8山东大学硕士学位论文异位内膜进一步增殖而发生子宫腺肌病。( 2 ) 细胞的破坏与自由基的作用密切相关。子宫腺肌病中，超氧化物歧化酶( S O D ) 、黄嘌呤氧化酶( x 0 ) ，一氧化氮合成酶( N O S ) 高表达廿上4 3 盯，表明自由基的代谢处于一种紊乱状态。其中，N O S 表达增高，从而使一氧化氮( N O )产生增多。N O 是人体内主要的信号传递分子，它参与机体内
9、多种生理和病理生理过程。C O X 一2 与i N O S 均具有调节上皮细胞增生及参与肿瘤血管形成的作用，C O X - 2的调节可通过包括N O 在内的各种内外源因素的影响。细胞的破坏与自由基的作用密切相关。羟自由基是最活跃的自由基之一，能破坏细胞内的D N A 和细胞膜。谷光甘肽过氧化物酶( G P x ) 是体内种清除羟自由基的酶，存在于子宫内膜的腺上皮。有周期性变化，受雌激素及其他性激素的调节。O t a m l 等研究发现腺肌病子宫内膜谷光甘肽过氧化物酶表达始终高于正常对照组，并认为子宫腺肌症病灶释放自由基增多，且在腺肌症的发生过程中，免疫细胞也可释放自由基，导致清除自由基的G P
10、 x 、S O D 增多。在随后的研究中发现与自由基产生及清除有关的多种黄嘌呤氧化酶在子宫腺肌病的在位及异位内膜中均过度表达，包括：超氧化物歧化酶、谷光甘肽过氧化物酶、氧化氮合成酶。机制尚不清楚。氧化氮合成酶( N o ) 在正常育龄妇女的月经周期中，增殖早期表达最低，逐渐增加至分泌中期达峰值。后逐渐下降。腺肌症患者除分泌期外均高于对照组。一氧化氮是一种高反应性自由基，其作用包括：细胞损害、血管扩张和信号转导。一氧化氮合成酶的增加导致一氧化氮的合成增加，其可能的作用包括：增加了子宫内膜的血管面积，导致月经量增多导致子宫异常收缩，影响精子活动度及运行引起不孕：影响早期胚胎发育，导致流产或畸形。5
11、 、免疫方面的因素：子宫腺肌病患者体内存在着一系列的免疫反应被激活，包括细胞表面抗原的强表达、增加的巨噬细胞或免疫周期的数目以及免疫球蛋白和补体成分的沉积。内膜细胞在免疫应急和通过合成热休克蛋白保护自身，激活的免疫细胞分泌不同的细胞因子或生长因子，刺激细胞表面抗原的表达，最终引起免疫“缺陷周期川“。在子宫腺肌病的在位和异位内膜的主要组织相容性复合物I I 型抗原( H L A O R ) 的表达增强，尤其是腺上皮细胞，异位内膜细胞的H L AI I 抗原为巨噬细胞识别，进而激活T 细胞并刺激B 细胞产生抗体，因此，内膜细胞的H L AI I 型抗原在子宫腺肌病的免疫反应中起着关键性作用。巨噬细
12、胞在在位内膜和异1 9山东大学硕士学位论文位内膜的数量增多，不仅有抗原呈递作用，而且通过细胞因子如白介素( I L ) 一1 和T N F 的作用。可能在该病所致的生育力降低方面发挥一定的作用。T 细胞在子宫腺肌病的在位和异位内膜增加与疾病引起的出血坏死而导致的炎症反应刺激有关，激活后通过分泌大量细胞因子，参与疾病的发生发展，同时也促进B 细胞分化和产生免疫球蛋白，后者在子宫腺肌病免疫调节中的作用尚不清楚。体液免疫也参与子宫腺肌病的发病过程，在该病患者的外周血中存在自身抗体，如磷脂次黄嘌呤I g G 、磷脂酰甘油I g G 和磷脂酰丝氨酸I g G 的增高，在切除子宫或使用达那唑治疗后，这些抗
13、体明显下降，这些与自身免疫性疾病和反复流产有关的抗磷脂抗体的存在，也预示了该病患者常常伴发不孕和体外受精成功率低。此外，补体系统通过沉积c 3 和c 4 也参与子宫腺肌病的免疫调节，据报道子宫腺肌病患者的补体c 3 、c 4 的沉积率分别增加7 4 和8 9 。除外以上研究发现，体外研究也发现内膜中激活的C D 3 4 T细胞及其分泌的Y 干扰素可以刺激内膜腺体细胞的H L A D R 免疫反应性，并抑制内膜生长。内膜细胞距离活性的T 细胞越近，其生长受抑制的现象越明显。淋巴滤泡结构大都定位于富于活性T 辅助细胞的内膜腺肌交界处，形态学上也恰巧与内膜细胞最受抑制位点相吻合，而子宫腺肌病子宫恰巧
14、缺乏活性的T 细胞，目前的发现虽然可以肯定免疫系统的异常参与了子宫腺肌病的发生，但还不清楚这一异常是否是独立的致病因素。6 、基底内膜内陷：过去5 0 年中，尽管提出了很多子宫腺肌病的发病理论，其中广为接受的是子宫腺肌病是子宫基底内膜腺体浸润、子宫基底层内膜向下生长和内陷的结果，在组织学上，常常可见基底层内膜与腺肌病病灶间密切相连的直接的连续性，说明腺肌病病灶与基底层内膜具有连贯性和一致性。发生基底内膜内陷的原因可能是子宫平滑肌薄弱或宫腔压力增加所致，一般认为先是存在子宫肌层的薄弱，之后出现基底部内膜内陷，再在多因素作用下发生病变。子宫肌层的薄弱可以由刮宫术、子宫肌瘤剥除、剖宫产等原因造成。在
15、腺肌病病灶区域出现的子宫肌细胞肥大增生可能是子宫肌层异位内膜的反应性变化，其确切机制不明。有学者认为子宫腺肌病源于基底层内膜浸润入“裂开”的子宫肌层中，可由子宫慢性蠕动和蠕动亢进引起。但子宫内膜“侵入”子宫肌层的诱发机制至今还不明确，内膜功能层中细胞有丝分裂活性及细胞核D N A 合成量明显大于基底层细胞根据动物模型研究的结果o ”，目前认为基底内膜内陷的发生过程如下：最山东大学硕士学位论文初是子宫内肌层肌纤维的退化，细胞体积缩小约1 3 ，细胞间隙空间扩大，发生这种肌层细胞排列紊乱后，内膜的腺体和问质进入肌层，最终出现子宫腺肌病。另一种可能是内膜一肌层连接带病变，即内膜下平滑肌肥大、正常带结
16、构的扭曲以及内肌层功能的紊乱，继发于内膜成分侵入后，易出现病灶。因此，无论直接由内膜因素还是间接由改变的免疫反应所引起的连接带的结构功能紊乱因素，均可能是子宫腺肌病发病机制中的起点。子宫内膜一子宫肌层连接区( e n d o m e t r i a l- m y o m e t r i a lj u n c t i o n ，酬J ) 是指子宫内膜与子宫肌层的连接区域，在结构与功能上具有特殊性。其生理作用有调节滋养细胞植入、局部免疫功能、特殊的收缩功能，7 、遗传学因素：现在认为子宫内膜异位症发病很可能是包括遗传基因在内许多因素共同作用的结果，而有关子宫腺肌病与基因遗传的研究很少。有作者从免疫遗传学角度比较子宫内膜异位症和子宫腺肌病HLA D Q A I * 0 3 0 1 和H L A - D Q A l 0 4 0 1 等位基因频率的差异，发现与正常对照组有明显不同，子宫内膜异位症及子宫腺肌病均与H L A - D Q M * 0 3 0 1 、0 4 0 1 相关联啪1 。K i t a w
