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1、学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。作者签名E t I l 1 ：艘盟：三! 翌学位论文使用授权声明本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论
2、文在解密后适用本规定。学位论文作者签名：吼啦日期：受瞳i 一一导师签名：f l 童书卜日期：鲎塑! y o 华东师范大学博士学位论文中文摘要人胎盘碱性磷酸酯酶( P L A P ) 在母鸡输卵管中的表达及其相关研究随着基因转移技术的不断发展和完善，利用转基因动物来生产基因药物是一项可以获得巨额经济利润的新型产业。目前采用生物工程方法生产的大多数药用蛋白为糖蛋白。其中寡糖链对糖蛋白生物学功能的体现非常重要。在常用的几种表达系统中，大肠杆菌表达系统因缺少蛋白质糖基化修饰所需的糖基转移酶，故不能对所表达的糖蛋白进行糖基化修饰；酵母和昆虫表达系统虽可以对其所表达的蛋白质进行糖基化修饰，但与哺乳动物细胞
3、的修饰方式差异很大。哺乳动物的研究中，有许多蛋白是在转基因鼠、兔、猪、绵羊、山羊和奶牛等的乳腺细胞中表达的，而哺乳动物乳腺反应器也存在如下不足或缺陷；世代间隔时间长，乳汁中的生化成分复杂，以及重组蛋白纯化的难度大等。为此科学家试图建立另外一种新的生物反应器鸡蛋生物反应器。与其它反应器相比，该反应器有蛋白产量高、易纯化和生产周期短等优点。人胎盘碱性磷酸酯酶( P L 廿) 是一种糖蛋白，该基因具有表达后容易检测、灵敏度高等优点，而在医学l 临床检测中被广泛使用，为此本课题将其选为报告基因。本实验同时选用具有雌激素受体的人乳腺癌M C F 7 细胞和Z R 7 5 3 0 细胞、不具有雌激素受体的
4、大肠癌细胞和原代培养的鸡胚细胞，来研究鸡细胞的糖基化和卵清蛋白基因启动子的雌激素依赖性表达调节，通过母鸡输卵管组织特异性表达体系的建立，实现P L A P 在母鸡输卵管中的表达。1 人胎盘碱性磷酸酯酶( p l a p ) 基因的获得采用P C R 方法从p S E A P 2 一c o n t r o l 质粒扩增p t a p 基因，该引物5 端含有一个B a m H I 酶切位点，3 端引物上含有一个勋o I 位点。同时，因p Z a p 基因内部有。个B a m H I 限制性酶切位点，因此需要再设计一对引物，在不改变氨基酸序列的条件下，使基因内部的B a m H I 酶切位点突变，即
5、扩增p 蛔p 基因需要分两步完成，第一步从p S E A P 2 c o n t r o l 质粒扩增获得P 印基因的两个片段，第二步通过P C R 方法将两个片段连接起来，获得全长p l a p 基因。2 p 如P 基因克隆及在大肠杆菌中融合表达将所获全长p 也P 基因克隆到p S K 载体上，构建p S K A P 质粒，并进行测序，再从p S K A P 质粒上切下测序正确的目的片段，克隆到大肠杆菌融合表达载体p E T - 3 2 a上，经P C R 扩增和限制性内切酶酶切鉴定后，鉴定正确的克隆转化到大肠杆菌菌株中表达，采用l O 不连续S D S P A G E 蛋白电泳检测目的蛋白
6、表达情况。用大肠杆菌华东帅范大学博J ：学位论史中融合表达的P L P 制各小鼠多克隆抗体，并通过W e s t e r nb l o t 杂交检测自制的小鼠多克隆抗体。3 构建含p 印基因的鸡输卵管组织特异性表达载体p A B S i g - S V 4 0 的基本组成元件如下：1 ) 调控输卵管特异性表达的启动子为o v a l b u m i n 基因的启动子，长度为1 4 5k b ：2 ) O v a l b u m i n 基因的第一个内含子，用来提高目的蛋白的表达量，长度为1 5 5k b ：3 ) S V 4 0 的l a r g eT 抗原的转录终止子，长度4 5 8b p
7、，含p o l y A 添加信号； 4 ) M A R ( M a t r i xa t t a c h m e n tr e g i o n ) 元件和A R S ( a u t o n o m o u s l yr e p l i c a t i n gs e q u e n c e s ) 元件，均以P C R 手段从鸡、鼠的总D N A 得到，长度为3 0 0 5 0 0b p ；将在大肠杆菌中表达目的蛋白的p t a p 基因片段，克隆到鸡输卵管组织特异性表达载体( p A B S i g S V 4 0 ) 上。4 转基因鸡生产1 ) p A B S i g A P S V 4 0
8、 质粒的大量制备。将大量抽取的质粒p A B S i g A P S V 4 0用限制性内切酶K p nI 酶切，使其线性化，纯化质粒后，分光光度计测定质粒的浓度。2 ) 制备脂质体并包埋表达载体D N A ，脂质体的大小通过控制组份比例调制在巾2 0 0n m 左右。每毫升脂质体包埋1 0 0u g 纯化后的D N A 。3 ) 采集新鲜精液，用3 7 预温的K r e b s 溶液洗精液，离心后收集精子并用K r e b s液悬浮，加入包埋有线性化输卵管组织特异表达质粒D N A 的脂质体，混匀后3 7 保温2 0 分钟，立即进行人工授精。4 ) 人工授精3 天后收集鸡蛋，3 7 “ C
9、孵化2 l 天得第一代转基因鸡。采用穿翅号、断趾、剪鸡冠进行标记，然后进行常规的饲养和管理。5 转基因母鸡的检测抽提鸡冠基因组D N A ，按p 地p 基因序列设计并合成引物，以p A B - s i g A P S V 4 0质粒模板为阳性对照，阴性对照采用不加任何模板、非转基因鸡基因组D N A 及含有等摩尔浓度p A B S i g - A P S V 4 0 质粒的非转基因鸡总D N A 为模板，对“转基因”第一代鸡基因组D N A 中p l a p 基因进行P C R 检测，检测片段长度为5 7 0 b p 。共孵化获得两组转基因鸡，第一组有9 5 羽母鸡第二批有1 2 8 羽母鸡。
10、经P C R 方法检测，第一组转基因阳性率为7 5 ，第二组阳性率为8 1 。P C R 阳性转基因鸡每个细胞中转基因质粒的拷贝数多于一个。2华东师范大学博士学位论义6 脂质体内添加组蛋白对转基因效率的影响脂质体中添加组蛋白对转基因效率影响的实验分两组进行，实验组脂质体中添加组蛋白，对照组中不添加组蛋白，实验结果表明。实验组转基因鸡阳性率比对照组转基因鸡阳性率高6 。这可能由于组蛋白有利于脂质体包埋D N A 的凝集，而且还有利于质粒D N A 进入细胞核，从而使转基因效率提高。7 P L A P 在母鸡输卵管中的表达收集转基因母鸡所产鸡蛋，分离蛋清，混合均匀，取蛋清4 微升加到3 0 微升S
11、 D S P A G E 上样缓冲液中混匀，沸水浴中变性5 分钟，以大肠杆菌融合表达产物为阳性对照，非转基因鸡蛋清为阴性对照，W e s t e r nb l o t 杂交检测转基因鸡蛋清中人胎盘碱性磷酸酯酶的表达情况。检测结果显示人胎盘碱性磷酸酯酶能在母鸡输卵管中顺利表达，并分泌到鸡蛋蛋清中。检测条带位于6 8 k D 下方，与糖基化人胎盘碱性磷酸酯酶大小基本一致，说明母鸡输卵管中表达的是糖基化的人胎盘碱性磷酸酯酶。对W e s t e r nb l o t 杂交检测呈阳性的转基因鸡鸡蛋蛋清进行P L A P 酶活性测定，测定结果显示，蛋清中表达的P L A P 具有正常的生物学活性。上述实
12、验结果表明母鸡输卵管腺细胞可以表达经过糖基化修饰的具有正常生物学活性的P L A P ，并分泌到鸡蛋蛋清中。8 转基因鸡传代提取“转基因”第一代公鸡精子细胞基因组D N A ，P C R 方法检测“转基因”第一代公鸡基因组D N A 中p l a p 基因，用P C R 方法检测呈阳性的“转基因”第一代公鸡和阳性“转基因”第一代母鸡交配，并收集母鸡所产种蛋，孵化出第二代“转基因”鸡，用P C R 方法对“转基因”第二代小鸡基因组D N A 中p l a p 基因进行检测，结果在“转基因”第二代小鸡基因组D N A 中检测到p l a p 基因条带，转基因鸡传代效率较高( 6 3 。6 4 )
13、。上述实验结果表明，公鸡精子细胞中的p l a p 基因可传递到后代鸡细胞中。9 卵清蛋白基因启动子雌激素受体细胞的依赖性表达p S E A P 2 c o n t r o l 和p A B S i g A P S V 4 0 质粒转染大肠癌细胞，转染4 8 小时后，以对硝基苯磷酸钠( p N P P ) 为底物检测P L A P 的活性，p S E A P 2 - c o n t r o l 和p A B S i g A P S V 4 0 质粒转染大肠癌细胞，测得培养基中P L A P 酶的活性分别为2 3 4U L 和5 3 U L ，而未转染质粒的大肠癌细胞培养基中相应的酶活性为5 3
14、 U L 。说明D S E A P 2 一c o n t r o l 质粒在大肠癌细胞中表达P L A P ，而p A B S i g A P S V 4 0 质粒在大肠癌细胞中，因不具有雌激素受体不能顺利表达。表明卵清蛋白基因启动子在不具有雌激素受体的细胞中没有转录活性，S V 4 0 启动子在大肠癌细胞中具有转录活性。华东帅托大学博t 学位论立p S E A P 2 - c o n t r o l 和p a B S i g A P - S V 4 0 质粒转染乳腺癌M C F 7 细胞，转染4 8 小时后，以对硝基苯磷酸钠( p N P P ) 为底物检测P L A P 的活性结果表明，p
15、 S E A P 2 一c o n t r o l和p A B - S i g - A P - S V 4 0 质粒转染M C F 7 细胞，测得培养基中P L A P 酶的活性分别为2 5 8 和1 8 8 U L ，而来转染质粒的乳腺癌M C F 7 细胞培养基中响应的酶活性为1 2 8 U L 。提示p S E A P 2 - c o n t r o l 和p A B S i g A P S V 4 0 质粒在具有雌激素受体的乳腺癌细胞中表达，卵清蛋白基因启动子在含有雌激素受体的M C F 7 细胞中具有转录活性，但较S V 4 0 启动予的转录活性弱。p S E A P 2 c o n
16、 t r o l 和p A B S i g A P S V 4 0 质粒转染乳腺癌Z R - 7 5 3 0 细胞转染4 8小时后，以对硝基苯磷酸钠( p N P P ) 为底物检测P L A P 的活性，结果表明，p S E A P 2 一c o n t r o l 和p A B S i g A P S V 4 0 质粒转染Z R 一7 5 - 3 0 细胞，测得培养基中P L A P酶的活性分别为1 6 5 和4 6 u ，L ，而未转染质粒的乳腺癌M c F 7 细胞培养基响应的酶活性为5 3 U L 。提示p S E A P 2 c o n t r o l 质粒在Z R 7 5 3 0 中表达，p A B S i g A P S V 4 0 质粒在具有雌激素受体的乳腺癌细胞Z R 7 5 3 0 中没有表达，卵清蛋白基因启动子在含有雌激素受体的Z R 7 5 3 0 细胞中不具有
