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1、微生物学通报 APR 20, 2008, 35(4): 524528 Microbiology 2008 by Institute of Microbiology, CAS 基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金 * 通讯作者：Tel: 010-68975891; : 收稿日期：2007-09-02; 接受日期: 2007-11-13 研究报告 甘草内生细菌多样性研究 张 敏 沈德龙* 饶小莉 曹凤明 姜 昕 李 俊 (中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 北京 100081) 摘 要: 以分离培养的方法对内蒙古鄂尔多斯市甘草基地野生及栽培甘草内生细菌的多样性进行了初步研究
2、。结果表明, 野生及栽培甘草植株内存在大量种群丰富的内生细菌。经 ERIC-PCR 指纹图谱分析, 共分离到 120 株内生细菌, 野生及栽培甘草均表现出根和叶部位的内生细菌数量多于茎部。 对其中 82 株进行 16S rDNA 片段测序分析, 结果表明这些内生细菌分别与 GenBank 中、-Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria 五类细菌中的 19 个已知属相似性达到 97100%。内生细菌的主要优势种群为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、泛菌属( Pantoea sp.)和沙雷氏菌属(Serra
3、tia sp.)。 关键词: 甘草, 内生细菌, ERIC-PCR, 多样性分析 Diversity of Endophtic Bacteria Isolated from Glycyrrhiza ZHANG Min SHEN De-Long* RAO Xiao-Li CAO Feng-Ming JIANG Xin LI Jun (Institute of Agricultural Resources and Regional planning, Chinese Academy of Agriculture Science, Beijing 100081) Abstract: 120 stra
4、ins of endophytic bacteria identified by ERIC-PCR were isolated from wild and cultivated Glycyrrhiza uralensis plants which collected from Erdos Innermongolia province. The identified results in- dicated that Glycyrrhiza uralensis plants has plenty of endophytic bacterium in density and population,
5、and the density is higher in root and leave than in stem. Partial sequence analysis of 16S rDNA gene of 82 strains indicated that these strains were in a high similarity with 19 known genus which belong to 、-Proteobacteria、Firmicutes and Actinobacteria. The dominant genus were Bacillus sp., Pseudomo
6、nas sp., Pantoea sp. and Serratia sp. Keywords: Glycyrrhiza, Endophytic bacteria, ERIC-PCR, Diversity analysis 中华宝草-甘草, 是我国两千多种草药中用量最大的一味药, 素有“十方九草, 无草不成方”之说。甘草为多年生豆科草本植物, 除了具有丰富的药用价值外, 还能生长在低温及夏季酷热的荒漠、半荒漠地带, 发达的地下根系使其能够防风、固沙固土, 是一种优良的生态先锋植物。另外, 近年来甘草在饲料、 食品、 化妆品等轻工业方面用途也越来越广泛。 长期以来, 我国对甘草的研究主要集中在化学
7、成分、药理作用、临床应用等方面, 并取得了显著成果1。 随着人们对甘草需求量的日益扩大, 发展人工种植甘草成为解决野生甘草资源不足, 保护环境的唯一出路。 目前, 人们已在甘草的育种, 栽培技术等多方面开展了研究, 而涉及到微生物与甘草之间的研究却开展得不多。 张 敏等: 甘草内生细菌多样性研究 525 http:/ 植物内生细菌(Endophytic Bacteria)是能定殖在健康植物组织并与植物建立了和谐联合关系的一类微生物2。内生细菌具有丰富而强大的生物学作用：固氮作用、促植物生长作用、以及增宿主植物抗逆境, 抗病虫害等作用3。到目前为止, 涉及到内生细菌研究的植物已达上百种, 其中研
8、究较多的植物有牧草, 棉花, 小麦, 高粱, 水稻, 玉米, 马铃薯, 甘蔗, 甜菜等, 但对中草药中内生细菌的研究仍不多见。为此, 本试验室采用微生物和分子生物学手段对甘草内生细菌进行了分离和鉴定, 对其类群及分布规律进行了初步研究。 1 材料和方法材料和方法 1.1 供试植物 试验用野生及栽培甘草选自内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗锡尼镇伊泰制药甘草基地。采样时, 于不同生长点采集多株野生及栽培甘草, 并与根际土一同带回实验室。 1.2 培养基 营养琼脂培养基： 牛肉膏3 g, 蛋白胨10 g, NaCl 5 g, 琼脂 18 g, 蒸馏水 1000 mL, pH6.87.0。 A4 无氮培养基：C
9、12H22O11 5 g, MgSO47H2O 0.5 g, CaCO3 0.1 g, Na2HPO4 2 g, FeCl3 0.005 g, 琼脂 18 g, 蒸馏水 1000 mL, pH7.0。 TSA 培养基：胰蛋白胨 15 g, 大豆蛋白胨 5 g, NaCl 5 g, 琼脂 15 g, 蒸馏水 1000 mL, pH7.17.5。 1.3 PCR 扩增所用试剂 PCR 反应体系购自天根生化科技北京有限公司, 引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。 1.4 内生细菌的分离与纯化 取采集到的甘草植株的根、茎、叶部位作为样品研究对象。 分别取 1 g 样品用流水冲洗多次, 滤纸吸干水分
10、, 75%酒精浸泡 3 min, 无菌水冲洗 56 次, 2% NaClO 浸泡 1 min20 min, 无菌水再冲洗 56次, 最后一次清洗的水涂 TSA 培养基平板检查灭菌效果。表面灭菌干净的样品放于无菌研钵中, 充分捣碎研磨后, 加入装有 10mL 无菌水的试管中, 混匀后梯度稀释 3 次, 取 0.1 mL 涂布到营养琼脂培养基和 A4无氮培养基上, 每个梯度每种培养基 3 个重复, 28培养 2 d3 d。根据菌落形态(大小、形状、颜色、表面光泽、透明度和质地等), 菌体形态(形状, 革兰氏染色反应、大小、排列方式和有无芽孢等)分别挑取不同类细菌, 在相应培养基平板上纯化, 纯化后
11、的内生细菌接于相应培养基斜面上，4保存备用。 1.5 内生细菌 DNA 制备 取5 mL 培养好的菌液于EP管中离心收集菌体, 1TE 缓冲液洗涤 2 次后, 加入 500 L GUTC 缓冲液混匀, 室温放置15 min, 加入40 L硅藻土吸附缓冲液, 振荡混匀, 室温放置 15 min 后, 13000 r/min, 离心 1 min, 弃上清, 沉淀加入 200 L GUTC 缓冲 液混匀, 室温放置 10 min, 13000 r/min, 1 min 离 心, 弃上清, 洗涤缓冲液洗涤 3 次, 每次 300 L, 8000 r/min, 3 min 离心, 200 L 70%酒精
12、洗涤 1 次, 真空抽干, 加 TE 缓冲液, 65下复溶, 13000 r/min, 5 min 离心, 吸取上清, 即为细菌 DNA。 1.6 内生细菌的 ERIC-PCR 扩增 ERIC 引物序列4： ERIC1: 5 -ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3 ERIC2: 5 -AAGTAAGTGACTGGGGTGAGC-3 反应体系(25 L)：细菌 DNA 模板 50 ng , 10buffer 2.5 L, MgCl2 (25 mmol/L) 5.6 L, dNTPs (2.5 mmol/L) 2 L, 引物(10 mol/L)各 1 L, Taq DNA 聚合酶 (2
13、.5 U/L):0.25 L, 加水补足 25 L。PCR 反应条件： 95 10 min; 95 1 min, 42 1 min, 72 1 min, 30 个循环; 72 8 min。反应结束后, 取5 L PCR 产物在 1%琼脂糖凝胶上电泳检测。 1.7 内生细菌的 16S rDNA 片段的测序分析 采用细菌通用引物 799f 5 -AACAGGATTA- GATACCCTG-3 和1492r 5 -GGCTACCTTGTTACG- ACTT-3 扩增内生细菌 16S rDNA 中的 V5、 V6、 V7、V8 及 V9 5 个高变区。反应体系(25 L)：细菌 DNA模 板 50 n
14、g, 10 buffer (Mg2+) 2.5 L, dNTPs (2.5 mmol/L) 2 L, 引物(10 mol/L)各 1 L, Taq DNA 聚合酶(2.5 U/L) 0.15 L, 加水补足 25 L。PCR 反应条件： 94 5 min; 94 1 min, 52 1 min, 72 1 min, 30 个循环; 72 10 min。 得到的序列长度约为 730 bp, 通过琼脂糖凝胶电泳检测后, 送上海生物工程技术服务有限公司测序, 将序列提交到GenBank 登记, 收录号为 EU088014-EU088095, 在GenBank中用 BLAST进行比对分析, 寻找具有较
15、高同源性的 16S rDNA 序列。 2 结果与分析结果与分析 2.1 甘草不同部位中内生细菌的分离结果 将采集的野生及栽培甘草不同组织器官根、 茎、526 微生物学通报 2008, Vol.35, No.4 http:/ 叶表面消毒后进行组织内部内生细菌的分离。结果发现, 在营养琼脂培养基和 A4 无氮培养基平板上均长出大量菌落, 菌落形态存在明显差异, 说明甘草组织中存在大量的内生细菌, 而且内生细菌的类群丰富。 通过对平板上的菌落计数, 发现不同样品之间内生细菌的菌落数分布在 3.10102 CFU/g 鲜重 1.37106 CFU/g 鲜重上。 将 A4 无氮培养基上得到的内生细菌涂布在营养琼脂培养基平板上, 去除与营养琼脂培养基上生长相同的细菌, 得到只能在 A4无氮培养基上生长的内生细菌, 这些细菌与从营养琼脂培养基分离得到内生细菌共同经过纯化及镜检, 根据菌落和菌体差异, 最终获得内生细菌 178 株。内生细菌详细分布情况见表 1。由表可知：内生
