《漆酶在染料脱色和疏水性芳香化合物降解转化中的应用研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《漆酶在染料脱色和疏水性芳香化合物降解转化中的应用研究（154页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、山东大学博士学位论文摘要环境问题是人类2 l 世纪所面临的几个重大问题之一，环境保护也因此成为许多科技工作者竞相研究的课题。随着生物科学和生物工程的迅速发展，生物技术在环境保护领域逐渐展示了巨大威力，酶在环境保护方面的应用已呈现出良好的发展前景。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，它能够催化大量的酚类和芳香胺类化合物的氧化，在小分子介体存在下，其氧化底物的范围还可进一步扩大。由于漆酶作用底物广，因此它在废水处理、生物漂白、芳香化合物转化、环境监测等方面具有重要的应用价值。漆酶的酶学性质与其来源有关，本文研究了I r p e xl a c t e u sd f t 1 漆酶催化染料脱色反应的动力学，考察
2、了反应介质条件和添加剂对脱色效果的影响，并利用响应面法研究了I r p e xl a c t e u sd f l 1 漆酶催化染料R B 亮蓝( R B B R ) 脱色过程中多参数之间的交互作用。本文还考察了不同类型表面活性剂( 阳离子型、阴离子型和非离子型) 和聚乙二醇( P E G ) 对漆酶酶学性质影响以及非离子表面活性剂T r i t o nX 1 0 0 对漆酶催化转化疏水性芳香化合物双酚A ( B P A ) 的影响及机制，研究了不同类型表面活性剂组成的反胶束体系中漆酶的催化性能，探讨了P E G 4 0 0 对A O T 异辛烷水反胶束中漆酶催化B P A 降解转化的影响及其
3、相应机制，为进一步研究漆酶在反胶束中催化转化芳香化合物提供了理论基础。一、I r p e xl a c t e u sd f l - 1 漆酶催化染料废水脱色来源不同的漆酶对染料废水降解和脱色的能力不同，其最佳反应条件也不同。由于介体价格较贵，因此寻求无介体的漆酶催化染料脱色体系可以有效地降低染料废水的处理成本。I r p e xl a c t e u sd f t - 1 漆酶是一种新型漆酶。本文选用了三种不同类型的染料，研究了在不加介体的情况下I r p e xl a c t e u sd f l 1 漆酶催化染料脱色反应的动力学，考察了反应介质条件和添加剂( 非离子表面活性剂) 对脱色效
4、果的影响。研究表明，I r p e xl a c t e u sd f t 1 漆酶可以在不加介体的情况下对葸醌染料茜素红、偶氮染料甲基红和三芳基甲烷染料溴甲酚绿较好地脱色。染料结构不同，脱色效果不同，而且最佳脱色p H 也不同。当加入T r i t o nX 1 0 0 和B r i j 3 0 后，由于低浓度下它们对漆酶有激活作用和稳定化作用，染料脱色率有所提高。山东大学博士学位论文响应面方法( R S M ) 运用了数学和统计学方法，可以用来建立模型、分析多变量间的交互影响作用，目前已经被应用于许多化学和生化过程的最佳化和评估独立变量间的交互影响。本文通过B o x B e h n k
5、e n 设计研究了I r p e xl a c t e u sd f t - l漆酶催化染料R B 亮蓝( R B B R ) 脱色反应中不同参数( 温度、p H 、酶浓度和反应时间) 之间的交互作用，得到了漆酶催化染料R B B R 脱色的二次模型。高F 值( 2 2 7 9 2 8 ) 和低P 值( 甲氧基酚 氯酚 溴酚。同时，漆酶转化底物的有效性随着底物分子量的增大而下降。1 1 3 3 漆酶在环境监测中的应用随着漆酶研究的不断深入，漆酶在酶传感器和免疫检测中的应用越来越广泛【9 7 。F r e i r e 等 9 8 】研制了漆酶流动注射电化学生物传感器并将其应用于检测造纸厂废水中的
6、酚类化合物。该生物传感器在3 个月内表现出极好的稳定性，检测限可到微摩尔级。Q u a n 等 9 9 1 研制了以戊二醛为载体将漆酶固定在铂金电极表面的酶生物传感器。此电极对A B T S 和邻苯二胺有极高的灵敏度和很好的稳定性。此电极最大的优点是构建方法简单、使用寿命长、稳定性好以及检测精度高。1 1 3 4 漆酶在其它环保领域的应用另外，漆酶还被广泛应用于土壤生物修复 8 1 ，l O O 、有机磷杀虫剂的降解转化 1 0 1 、橄榄油生产废水处理【1 0 2 】、纸浆造纸废水处理【1 0 3 】、城市废水处理 1 0 4 】等领域。随着研究的不断深入，人们对漆酶分子结构、酶化机理等有了
7、更深入的了解，漆酶必将在环境保护领域有着更为广阔的应用前景。1 2 胶束酶学6从1 9 7 7 年M a r t i n e k 等的研究开始，胶束酶学成为分子生物学中新的物理化学山东大学博士学位论文分支。胶束酶学用于研究酶在表面活性剂溶液中的催化反应，包括在水溶液中( 形成胶束或囊泡) 或有机溶剂中( 形成反胶束或反囊泡) 的研究 1 0 5 1 。1 2 1 表面活性剂水溶液中的酶反应1 2 1 1 表面活性剂的结构和分类从化学结构上考虑，表面活性剂是一种两亲分子，即分子中的一部分具有亲水性质，而另一部分具有亲油性质。表面活性剂分子的亲油部分一般由碳氢原子团( 烃基) ，特别是由长链的碳氢
8、基构成。亲油基团的差别主要表现在碳氢链的结构变化上，差别较小。表面活性剂的性质主要由亲水基团决定，因此，表面活性剂通常按亲水基团结构和性质分类。而亲水基团的结构变化多端，但可以分为两类：溶解于水后能离解成离子的离子型表面活性剂和在水中不能离解的非离子型表面活性剂。离子型表面活性剂按其所带电荷种类，进而可以分为阴离子、阳离子和两性表面活性剂 1 0 6 ，1 0 7 1 。1 2 1 2 表面活性剂的H L B 值和临界胶束浓度表面活性剂的H L B 值指表面活性剂分子中亲水基团和亲油基团的大小和长度的平衡，其变化范围为1 4 0 ，H L B 值低说明表面活性剂亲油性强，而H L B 值高说明
9、表面活性剂亲水性强。一般认为，形成反胶束的表面活性剂的H L B 值在3 - 6 ，而形成胶束的表面活性剂的H L B 值在1 0 1 8 。当表面活性剂溶解在极性溶液中，其浓度超过一定值，即通常所说的临界胶束浓度( C M C ) 后，形成胶束结构。大于C M C 时，胶束占主要形式，但系统中仍存在以单体形态存在的表面活性剂分子。通常认为，胶束内核是由表面活性剂分子的疏水基团构成的具有液态性质的非极性区域，而其外层则由水化的表面活性剂极性基团和水溶液组成。7山东大学博士学位论文1 2 1 3 酶在表面活性剂溶液中的催化特性人们对水溶液中表面活性剂对酶活性的影响做了较多的研究【1 0 8 1
10、2 0 。表面活性剂影响酶活性，这是因为：它们可以与底物竞争酶的活性中心；它们可以改变酶的工作环境；在高表面活性剂浓度下，因为底物在表面活性剂胶束的分配增加，降低了自由底物的浓度 1 2 0 1 。酶与表面活性剂的相互作用包括表面活性剂头基与酶的带电氨基酸残基之间的静电相互作用以及表面活性剂烷基链与酶的疏水氨基酸残基之间的疏水相互作用。因此，酶结构和电荷以及表面活性剂的化学性质( 如头基电荷与大小、烷基链的长度与疏水性) 都对两者相互作用起着决定性的作用。这些相互作用引起了酶构象及活性中心的改变，从而影响酶的活性和稳定性【l l l ，1 2 1 1 。1 2 2 反胶束酶学研究1 2 2 1
11、 反胶束的结构和性质反胶束是由两亲分子溶解在有机溶剂水中自发形成的热力学稳定、光学透明的球形聚集体。从结构上讲，反胶束由一个由烃链组成的外壳和一个纳米尺寸的“水池”所组成。表面活性剂的疏水尾指向有机溶剂，极性头聚集形成极性腔，且在该极性腔中包含水 1 2 2 1 。反胶束的结构如图3 所示。形成反胶束体系的表面活性剂通常有：阴离子表面活性剂，如琥珀酸二辛酯磺酸钠( A O T ) 、十二烷基磺酸钠( S D S ) 等；阳离子表面活性剂，如十六烷基三甲基溴化铵( C T A B ) 等；非离子表面活性剂，如苯酚聚氧乙烯( 9 ) 醚( T r i t o nX 1 0 0 ) 和月桂醇聚氧乙烯
12、( 4 )醚( B r i j 3 0 ) 等以及两性表面活性剂，如卵磷脂等。8山东大学博士学位论文图3 反胶束结构图对于给定的表面活性剂，反胶束的性质取决于表面活性剂的水化程度W o ( 定义为反胶束体系中水与表面活性剂的摩尔比) ，即反胶束的含水量。随着含水量增加，水池逐渐增大。水在反胶束中以两种形式存在：自由水和结合水，后者由于受到双亲分子极性头基的束缚，具有与主体水( 普通水) 不同的物化性质，如粘度增大、介电常数减小、氢键形成的空间网络结构遭到破坏等 1 0 7 ，1 2 3 1 。正是反胶束体系的这种性质，它能够较好的模拟酶的天然环境，且在此体系中，大多数酶能稳定并保持其催化活性，
13、甚至表现出超活性。2 0 多年来，脂肪酶【1 2 4 1 、碱性磷酸酶 1 2 5 1 、酵母乙醇脱氢酶 1 2 6 、辣根过氧化物酶 1 2 7 1 、木素过氧化物酶 1 2 8 1 、酪氨酸酶 1 2 9 1 等5 0 多种酶在反胶束中的催化特性得到了广泛而深入的研究。1 2 2 2 酶在反胶束中的定位和结构反胶束为酶提供了发挥其作用的最佳微环境，酶在反胶束中的定位与蛋白的疏水性有关 1 3 0 。实际上，亲水性酶( 比如胰凝乳蛋白酶) 可以位于反胶束水核中避免与有机溶剂接触，表面活性酶( 比如脂肪酶) 可以与内胶束界面作用，而膜蛋白( 比如碱性磷酸酶) 可以与胶束界面的疏水部分作用。9山
14、东人学博士学位论文O r g a n i cs o l v e n t图4 酶( E ) 和底物( S ) 在反胶束内不同定位图E l ：亲水性酶E 2 ：表面活性酶E 3 ：疏水性酶酶反应的底物可以在反胶束和有机相间分配，反胶束结合底物可以在胶束界面和内部水核间分配，所以胶束结合酶既可以与亲水底物，也可以与疏水性底物作用，反应可以在不同定位下的许多微环境中进行，这与酶的定位和活性有关( 图4 ) 。人们应用了许多技术来研究反胶束中酶结构的变化，比如：圆二色谱( C D )【1 3 1 ，1 3 2 、稳态分析 1 3 3 1 、时间分辨荧光谱 1 3 4 、小角X 一射线散射( S A X
15、S )【1 3 5 、电子顺磁谐振( E P R ) 【1 3 6 、动态光散射( D L S ) 【1 3 7 、傅里叶变换红外光谱( F T I R ) 【13 8 ，13 9 和H N M N l 4 0 等。N a o e 等 1 3 1 1 运用圆二色谱法研究了A O T 反胶束中蛋白的高度有序结构。水溶液中和反胶束中细胞色素C ( 胶柬界面溶解酶) 的C D 光谱明显不同，且其二级结构和三级结构均随水含量的变化而发生改变。核糖核酸酶A 溶于胶束水池中心，其椭圆率在近紫外区与W o 有关，而在远紫外区则几乎不变，表明核糖核酸酶的三级结构受水含量影响，而二级结构不变。当蛋白大小与胶束尺
16、寸相当时，其结构更容易受水含量影响。蛋白与胶束界面的相互作用是影响蛋白在反胶束中构象的决定性因素，这与酶的定位和胶束界面的状态有关。l O山东大学博士学位论文A n d r a d e 等【1 3 4 1 从时间分辨荧光谱和丙烯酰胺淬灭研究中发现，A O T 反胶束中( W o = 2 0 ) 的a 胰凝乳蛋白酶类似于主体水环境，因此酶在反胶束中表现出较高稳定性。M e l o 等 1 3 7 1 使用动态光散射研究了角质酶结合至J J A O T 反胶束中酶的构象。结果表明，角质酶结合到胶束墙，引起酶伸展。角质酶与A O T 界面的相互作用是引起酶伸展的主要作用力。溶入2 4 d , 时后，角质酶伸展，明显观察到双峰分布。含酶反胶束的半径大于不含酶反胶束的半径。C h e n 等【1 3 8 】利用傅里叶变换红外光谱检测了辣根过氧化物酶( H R P ) 在A O T 、C T A B 和S
