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1、遗传H E R E D I T A S ( B e i j i n g ) 7 ( 6 ) ：4 6 -4 8 1 9 8 5植物染色体技术的进展张自 立（ 南开大学生物系， 天津）植物染色体技术已广泛地应用于细胞学、 遗传学、 作物育种学、 植物分类学和植物染色体 工程等领域，它对这些领域的研究工作有着重 要作用。近十年来，植物染色体技术有很多新进展， 现作一概述。一、制片技术的进展从B e l l in g ( 1 9 2 1 ） 提出 染色体压 片技术后， 压片已成为植物染色体研究中最广泛采用的常 规技术。但对有些材料来说，欲得染色体分散 而平整的图象则十分困难。徐道觉（ 1 9 5 2
2、 ) 、徐 道觉和 P o m e r a t ( 1 9 5 3 ） 发现， 用低渗溶液处理 哺乳动物细胞使其膨胀， 能促使染色体更好地 分散o R o t h # e ls 和S i m in o v i t c h ( 1 9 5 8 ） 提出一种空 气千燥技术， 使染色体平整地贴在载片上。 这些 r已使动物染色体技术有突破性改进的方法， 却 一时难于应用到植物染色体上，因为植物细胞 有很坚硬的细胞壁。七十年代后植物原生质体 技术有了发展， 消除细胞壁的方法已得到解决。 于是 M o u r a s ( 1 9 7 5 ) , M o u r a s 等（ 1 9 7 8 ) t2 ，
3、便有 可能用烟草等组织经酶解去壁，捣碎后过滤和 离心， 制成悬液， 再低渗处理，用空气干燥技术 进行植物染色体制片， 得到了分散的图象。K u - r a t 。 和 O m u r a E le l 将水稻根尖分生 组织进行酶 解，用火焰干燥法制备染色体标本也取得了较 好效果。陈瑞阳等 （ 1 9 7 9 , 1 9 8 0 ）用去壁、 低渗 法对3 7 科1 0 5 种植物进行了广泛研究， 效果良 好。M u r a t a 2 2 1 以芹菜悬浮培养的细胞和甘蓝的 愈伤组织， 酶解去壁， 低渗处理后制片，也获得 了满意的绪果。上述方法虽然在细节上各有差 别，但其主要步骤均包括有：为积累中
4、期分裂 相而进行 的前处理；细胞壁酶解或原生质体的分离； 低渗处理； 类似动物染色体技术中采用的 滴片或涂片； 空气于燥等。实验证明， 植物染色 体制片中的去壁低渗技术可以显著提高染色体 的分散程度和乎整性。目前去壁低渗制片技术 虽然还未普遍推广应用，但它确是很有前途的 新技术，它将在植物染色体研究中起着重要作用 。二、分带技术的进展染色体分带是七十年代兴起的细胞学新技 术，它通过一系列处理使染色体显示出特定带 纹，从而增加了识别染色体的新标志。自瑞士 细胞化学家C a s p e r s s o n ( 1 9 6 8 ) 提出荧光分带开 创了染色体分带新纪元以来，据 T h o m a ：
5、 等 ( 1 9 8 2 ） 统计，在植物方面已有9 0 种植物进行了 分带研究， 它对植物的核型分析、 亲缘关系或远 缘杂种鉴定起了重要作用。 植物染色体分带技术 中C带技术应用最 广，它是显示染色体上组成异染色质区的一种 方法。 S u m n e r ( 1 9 7 2 ） 首先提出 B S G法，即 染色体标本经饱和氢氧化钡处理， 在 2 X S S C ( 0 3 M N a C 1 和0 . 0 3 M N a 3 N 尹5 0 7 ） 溶液中温育， G i e m s a染色后显示带纹。后来 Me r k e r ( 1 9 7 3 ) 用醋酸， B u r g e r ( 1
6、9 7 4 ）用盐酸代替氢氧化钡， 分别提出了 A S G法与HS G法, D 6 b e l 等( 1 9 7 3 ) 提出尿素法，本文作者切用胰酶法均获得了C 带。所有这些方法中B S G法应用最普遍， 几乎 多数植物染色体用此法均能显带。 G e r l a c h l“ l , J e w e l l l1 6,在麦类作物中用 1 M N a H ,P O , ( 9 4 - C ） 处理若千分钟， G i e m s a染色后Z h a n g Z r l i : De v e l o p me n t o f T e c h n i q u e f o r P l a n t Ch
7、r n mn s o me 弓6显示出N带。 另一个方法是M a t s u i 等 （ 1 9 7 3 ) 在 哺乳动物染色体分带中应用的三氯醋酸- H C I 法，即气干后的染色体标本，置于 5 外三氯醋 酸中 9 0 处理6分钟， 水冲洗， 再用 0 . 1 NHC I ( 6 0 - c - ） 处 6 分钟， 水洗后G i e m s a 染色。本文 作者曾用于蚕豆、洋葱染色体，获得了良好效 果E3 1 0 N带与C带的位置相比较，大多数带纹 是一致的， 但也有少数带纹有区别。目前认为，N带并非对核仁组织者区有专一性。 对核仁组织者区有专一性的染色技术是银 染法。S c h u b
8、e r t 等( 1 9 7 9 ） 将蚕豆染色体标本在 A g N 0 3 溶液中6 5 处理 1 2 . 5 小时， 水冲洗后 染色体呈金黄色， 核仁组织者区显示黑色。B u - r g ，等 （ 1 9 8 0 ）用银染法研究了 V i c i a s a l i v a , R o b e rt ( 1 9 8 1 ） 研究了P i s u m , C e r m e n 。等E7 3 研 究了小麦和黑麦染色体的核仁组织者区。 V o s a ( 1 9 7 2 , 1 9 7 4 ) , Y a m a s a k i ( 1 9 7 3 ) , P i - g n o n e 等（
9、 1 9 8 0 ) , S c h w a r z a c h e r 等E2 3 , D e u m l i n g 等a报道了荧光带的研究。荧光带的位置与C 带相比， 除少数带纹有差别外， 基本上一致。 徐道觉和施立明（ 1 9 8 2 ） 首先用放线菌素D 诱导玉米根尖染色体G带获得成功，这是植物 分带 技术上 的新突破 。朱风绥( 1 9 8 4 ） 将此 方法 应用于大麦， 本文作者（ 1 9 8 4 ） 用于黑麦， 也取得 初步结果。D r e w r y s ) 将松树染色体标本空气干 燥后， 在4 5 一6 0 0C烤箱烤I 一1 2 小时， t r y p s in - E
10、 D T A液处理，G i e m s ： 染色， 显示了G带。 但 不少研究者对 t r y p s i n - E D T A 法的可重复性有 怀疑。 有关植物染色体分带机制的报道很少， G e - n d e l ( 1 9 7 8 , 1 9 8 0 1 1 的 实验 证明染色体蛋白 在 形成C带中起重要作用。本文作者11经过实验 认为，染色体上异染色质的核蛋白比常染色质 区更能抵抗显带程序中各种处理的影响，染色 体臂上有选择性地丢失核蛋白是显带的主要原 因。对植物染色体分带机制缺乏研究，必然限 制了分带技术的改进和提高，有必要加强研究。 姐妹染色单体区分染色（ S C D ） 技术为
11、分析 S C E频率检测各种环境诱变因素提供了有效手段。 植物 S C D技术迄今只有很少几篇报道， 如：K i h l m a n等 ( 1 9 7 5 , 1 9 7 7 , 1 9 7 8 ) ， S c h e id ( 1 9 7 6 ) , S c h v a r t z m a n等 ( 1 9 7 7 ) , F r i e b e ( 1 9 7 8 ) , S c h u b e rt等（ 1 9 7 9 , 1 9 8 0 ) 。 其未能得到广泛研 究和应用的原因之一是所有研究者均沿用了K ih lma n提出的 F P G法1 1 7 7 ， 它的程序繁杂，不 便推广。
12、本文作者4 3 建立了一种更简便、快速 的 B r d U - G ie m s ：技术， 为进一步开展植物 S C E研究提供了方便。三、染色体分离技术的进展在染色体的生化分析、 结构研究、 遗传操作 试验中，常希望得到大量纯的染色体。早在六 十年代就有人以根尖分生组织捣碎后过滤、离 心法分离出大量染色体， 但纯度较差， 收率也 低。近年来，植物细胞培养和原生质体研究的 进展给染色体分离技术打开了新路。M a l m b e r g 等11 9 ， 首先从植物原生质体中分离到纯度较高的 染色体。S z a b a d o s等I2把从原生质体中分离得 到的小麦或芹菜染色体用P E G诱导，
13、使它们进 人了玉米原生质体中。G r i e s b a c h 等1 1 4 1 试验了约 2 5 0 种不同的分类缓冲液，提出了一种适合分 离不同种和不同组织中植物染色体的缓冲液系 统。H a d l a c z k y t S 3 证明用甘氨酸- 2 一 甲基- 2 , 4 - 戊 二醇缓冲液分离出的大量染色体，从形态上和 生化组成上均保持完整不变。 染色体分离新技术包括下列步骤：( 1 )细 胞分裂同步化 先用轻 基腺 ( 2 . 5 m M 场 d r o - x y u r e a ） 处理培养细胞2 4 小时， 用培养液冲洗3 次，然后加人秋水仙素，使染色体停留在中期 相。 (
14、2 ） 用离心法（ 1 0 0 8 , 5 m in ） 收集细胞， 放人酶 液， 制成原生质体。酶液包括6 务 C o l lu l a s e , 2 并 R h o z y m e , 2 % P e c t i n a s e , - 5 % D r i s e l a s e 等多种酶。 并且必须用特定的分离缓冲液配制。酶解后仍 用缓冲液冲洗。( 3 ） 将原生质体悬浮在甘氨酸 2 一 甲基_ 2 ,4 一 戊二醇缓冲液中1 0 分钟， 加人曲 拉通 X - 1 0 0培养5 分钟， 用吸管来回吹吸帮助 破膜， 染色体便从细胞中释放到缓冲液。( 4 ） 在 蔗糖溶液中离心 （ 1 2
15、 0 g , 1 5 m i n ) , 核和细胞碎片 沉淀下来， 染色体悬浮在上清液中， 通过多次离 47 心可以提高纯度。 进行染色体分离时，培养细胞的分裂指数 至少在2 5 务以上， 否则收率很低。酶解不合适 会降低分裂指数，破膜不合适常导致染色体消 失。破膜后的操作要在。 -4 进行。 整个分 离技术中， 缓冲液的选择也比较重要。 目前染色体分离新技术虽然从纯度和收率 上已有很大提高， 但效果欠稳定， 有待改进。四、染色体 D NA 的原位杂交七十年代以来， D NA原位杂交不仅广泛 用于原核生物的D N A顺序组织（ S e q u e n c e o r g a - n i z a
16、 t io n o f D N A ) 分析， 而且在谷类作 物中 开 始做了大量研究，使人们对高等植物染色体结 构的分子基础有了一定的认识。 染色体 D N A 原位杂交技术也使高等植物的基因定位和杂种 鉴定上进人了新的分子生物学水平。高等植物 染色体组中7 0 -8 0 外（ 约6 X 1 0 k b ） 的D N A为 重复顺序。R i m p a u等2 3 3证明， 小麦基因组中只 有4 0 -4 5 拓，黑麦只有3 0 -3 5 务 由非重复顺 序所组成，它们散布在重复顺序之间。小麦基 因组中5 0 界以上的D N A , 黑麦6 0 关 D N A是重 复顺序， 它们以串联式排列。G e r l a c h 等 （ 1 9 8 0 )也详细报道了小麦染色体上高度重复顺序 D N A的分布。 B e d b r o o k 等 对黑麦染色体端位 异染色质的高度重复顺序 D N A进行了详细研 究。它们是由长度不等的1 2 0 b p , 4 8 0 b p , 6 1 0 b p , 6 3 0 b p 序列串联组
