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1、GE Healthcare Life Sciences应用文章通用电气医疗集团生命科学部, 2012生物制药工艺中无热原缓冲液的快速制备摘要 为保证生物制品质量和安全性，生物制药生产工艺中需要对内毒素进行严格控制。制药工艺中采用无热原缓冲液可以从源头更有效的避免内毒素对产品的污染，降低分离纯化工艺对内毒素去除能力的要求，实现更稳定可靠的生产过程。本文采用内毒素挑战实验对制药级中空纤维超滤膜的内毒素截留效率进行验证和评价，取得了满意的结果。1 介绍热原（Pyrogen）又称内毒素（Endotoxin）, 源于革兰氏阴性（Gram-negative）细菌的细胞外璧，其化学本质是一种脂多糖物质，相对
2、分子质量从几十万到几百万不等。内毒素经过注射进入人体血液会引起发热、白细胞减少、弥散性血管内凝血等热原反应，严重者会引发休克甚至致死1。因此，为保证药品质量和用药安全，内毒素的控制和去除成为药品工艺开发和工艺控制的重要环节2，中华人民共和国历届药典也明确将内毒素检测作为各种生物制品重要的检定指标之一3。近年来，全球蛋白类药物的增长十分迅速，大规模发酵技术、高表达细胞株的构建以及大规模公斤级蛋白纯化技术的发展引领生物制药领域进入了新的时代。对于大剂量的药用重组蛋白药物，如人血清白蛋白 (rHSA) 和单抗而言，内毒素的控制和去除面临更加严峻的挑战7。以单抗药物美罗华 (MabThera) 为例，
3、其推荐剂量可达 500-600mg/dose4，终产品内毒素要求 1.25x107 EU/ml 缓冲液：PBS 磷酸盐缓冲液 中空纤维过滤系统：QuixStand 切向流系统 , FlexStand中试切向流系统 制药级中空纤维超滤柱：UFP-5-C-4MA, 5kDa MWCO 截留分子量 , 0.065 平方米 制药级中空纤维超滤柱：UFP-5-E-6A, 5kDa MWCO 截留分子量 , 0.28 平方米 囊式滤器：ULTA Prime GF, 0.05 平方米，玻纤 分析方法：LAL 内毒素分析试剂盒 ( 灵敏度 0.03EU/ml)，湛江安度斯3 实验过程3.1 内毒素挑战实验使用
4、 1M NaOH 对 UFP-5-C-4MA 中空纤维膜和 QuixStand系统全回流方式清洗消毒 60min 彻底去除内毒素，然后使用注射用水 (50-100L WFI/ 平方米膜面积 ) 冲洗，透过端取样检测内毒素小于 0.03EU/ml，然后排空系统。大肠杆菌裂解液经过 1 微米 ULTA Prime GF 囊式滤器澄清，制备得到超过 1.25x107 EU/ml 的高内毒素挑战样品。使用UFP-5-C-4MA 中空纤维膜进行挑战实验，过膜压力 (TMP)为 2bar，收集透过端进行 LAL 内毒素检测，计算得到滤膜的内毒素截留效率。3.2 无热原缓冲液的透过通量中空纤维制备无热原缓冲
5、液的过程中，透过通量也是重要的参数，直接决定后期吨级缓冲液制备所需膜面积和超滤系统的放大选型。我们以PBS磷酸盐缓冲液为例， 分别采用0.065平米和0.28平米中空纤维 5k 超滤膜进行无热原缓冲液的制备。循环流速 4000/sec5，室温下进行实验，测量比较不同规模中空纤维超滤柱透过通量， 为进一步工艺线性放大提供依据。本文采用严格的内毒素挑战实验，对于截留分子量 5k 的制药级中空纤维超滤膜的热原截留去除能力进行验证和评价。结果显示，5k 的制药级中空纤维膜的热原去除能力(Log Reduction Value, LRV) 大于 7.7 log，无热原缓冲液制备速度大于 70LMH/ba
6、r，可以很好的满足生物制药中无热原缓冲液的安全快速制备。图2 中空纤维操作示意图率的同时保持高的透过通量，通过严格的完整性测试；无大孔隙的滤膜结构提供良好的物理化学性质，滤膜入口耐压超过 4.5 bar，并且可以耐受 1M NaOH/300ppm 次氯酸钠加热状态下进行消毒清洗以彻底去除热原。制药级中空纤维膜专为生物制药工艺而设计， 符合各项法规验证要求，广泛应用于生物制药工艺6。图3 工业中空纤维过滤膜4 实验结果4.1 内毒素挑战实验根据样品内毒素检测结果，内毒素去除能力评价总结于下表：IDEU/mlEndotoxin Clearance FactorLRV (Log Reduction
7、Value)Endotoxin Challenge sample (截留端)1.25x 107/Permeate (透过液)5x107倍7.7log实验结果表明，面对 1.25 x 107EU/ml 的高内毒素挑战样品，中空纤维滤柱（5kDa 截留分子量）可以有效截留溶液中的内毒素：膜透过液中内毒素含量小于 0.25EU/ml。中空纤维内毒素截留清除大于 5x107倍，内毒素去除能力(LRV) 大于 7.7 log。4.2 无热原缓冲液的透过通量改变不同的 TMP，分别对两种规模的中空纤维 5k 超滤柱进行通量测定，作如下曲线。5 总结制药工艺中采用无热原缓冲液可以从源头更有效的避免内毒素对产
8、品的污染，降低分离纯化工艺对内毒素去除能力的要求，有利于降低生产失败率，实现更稳定可靠的生产过程。本研究成功的采用内毒素挑战实验对中空纤维 5k 超滤膜进行内毒素去除能力的验证，并且对不同规模滤柱的透过处理通量进行比较，为放大选型提供了有力依据，结果表明：中空纤维滤柱 (5k MWCO)，对于 1.25x107 EU/ml 的高内毒素挑战样品，可以有效截留内毒素。膜透过液中内毒素含量小于 0.25EU/ml。中空纤维内毒素清除大于 5x107倍，内毒素去除能力大于 7.7 log，具有非常理想的内毒素截留清除效率。中空纤维滤柱 (5k MWCO) 具有较高的处理速度，处理通量大于 70LMH/
9、bar；实验室规模和中试规模的中空纤维滤柱的通量和不同 TMP 压力保持良好的线性关系，相关系数大于 0.999。新型制药级中空纤维膜专为生物制药工艺和生物技术样品设计开发，其生产工艺先进、质量控制严格，将滤膜生产批间差异降至最低 ； 不同规模的滤柱采用相同的流道设计，可以直接按比例进行可预测的线性放大，保证生产工艺的稳定可靠。6 致谢感 谢 Craig Robinson 先 生 (Global Technical Director, GE Healthcare, Westborough, USA) 对此文章的宝贵意见和帮助。由图 4，对于实验室规模 (4MA) 和中试规模 (6A) 的中空纤
10、维滤柱，其压力和通量之间成良好的线性关系，相关系数大于 0.999 以上，表明制药级中空纤维膜加工工艺先进、质量控制严格可靠，不同滤柱批间差异极小，可以直接按比例进行可预测的线性放大。中空纤维滤 5k 超滤柱具有较高的处理速度，透过通量大于70 LMH/bar。 根据此处理速度计算， 2bar的工作压力下，26 平方米中空纤维滤柱 (13 平方米 x2 根滤柱 ) 每小时可制备无热原缓冲液 3.7 吨以上。图4 中空纤维透过通量-压力曲线（Flux TMP）参考文献1. Thmas M, et al, Preparation of pyrogen-free solution for medic
11、al use. Eur. Pat. Appl., 312104, 19892. So-Hee Lee,et al, Optimization of buffer conditions for the removal of endotoxins usingQ-sepharose,Process Biochemistry 38 (2003) 1091_/10983. 中华人民共和国药典，2010 年版，三部，中国医药科技出版社4. 美罗华药品说明书5. 中试和工业规模过滤产品选择指南，GE Healthcare，2011年 8 月6. 中空纤维使用手册，GE Healthcare7. 苗景赟等 , 中空纤维膜过滤技术在单抗生产中的应用 , 生物产业技术, 2009 (2):57-64? ?GE Healthcare China2011 General Electric Company-All rights reserved 2011年12月
