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1、real time RT-qPCR 是检测样本中特定基因表达量的有效方法，包含逆转录步骤和定量 PCR 步骤。好的开始是成功的一半，获得高质量的、能正确反应样品中转录情况的 RNA，对于其后的定量结果，自然是非常重要的。Mikael Kubista，教授, R Hartshornet al., 2005b)，该方法基于稀释法，并且不需要将 RNA 结合到任何纯化基质上去，因此保证了实质上纯化得到完整的 RNA 库。此外，我们觉得转录产物的完全去蛋白化对于 RT 引物与模板的正确结合、以及最终模版定量的精确性和可重复性来说是十分必要的，这就像对基因组 DNA 模板制备来说是必需的一样。PurAm
2、p 方法有时要求一个 DNase 消化的步骤，但是我比较喜欢避免这一步。我尝试过多种 DNase 操作方法，但结果总是发现回收的 RNA 比预期的少。这可能是因为最后一步高温失活酶的步骤导致了 RNA 的水解。一些商品化的手册表明经过“+ / - DNase”处理后的实时 PCR 循环，特定样品的信号会出现几个循环的Ct 漂移（shift）。其实，考虑到每个细胞中特定的基因的拷贝数比该基因表达时的转录产物的拷贝数少得多，这种漂移几乎是难以察觉的，因此，不应该在 DNase 消化后稀释模板数量。我喜欢一起扩增 DNA和 RNA 模板，最后消减去基因组 DNA 的拷贝数（详细请见 Question
3、 5）。Jim Huggett，佛蒙特州大学（University of Vermont）癌症中心：我们在英国的实验室通常利用 Agilent Bioanalyzer 评估核糖体 RNA 条带来评估纯化 RNA 的质量。然而，由于我们在撒哈拉以南的非洲国家开展许多研究工作，这里仪器缺乏，所以我们要用琼脂糖凝胶电泳来评价 rRNA，从而告诉我们核糖体 RNA 条带是否 OK，以及我们的 RNA 提取工作是否有效；然而，越来越多证据表明，这些 rRNA 条带的降解不一定意味着 mRNA 降解。用什么方法进行质量评估是个人的喜好，现有的评估方法还是必需的。Xiuling Zhang,纽约州卫生署（N
4、ew York State Department of Health）Wadsworth Center:对于从人类组织中分离的 RNA 样品来说，我的高质量 RNA 标准是：1. rRNA 比率 28s/18s 1. 1, RNA 完整系数 (RIN) 7 (利用 Bioanalyzer 2100 进行分析)2. 28s 和 18s 条带明显(变性琼脂糖凝胶电泳)3. 比率 260nm/280nm 2.0 (分光光度计测量)。DNADNA 及及 RNARNA 含量测定方法含量测定方法发布日期：2008-08-11 来源：生技网信息中心 浏览次数：1072一、光密度测定法 原理 DNA 和 RN
5、A 在 260nm 处有一很高的吸收峰，利用这个原理我们测其OD260，再推算出其浓度。 一、光密度测定法一、光密度测定法 原理原理 DNA 和 RNA 在 260nm 处有一很高的吸收峰，利用这个原理我们测其 OD260，再推算出其浓度。 仪器仪器 分光光度计(紫外可见光两用)。 试剂试剂 水，DNA 或 RNA 溶液。 操作操作 (1)取 5ulDNA 样品或 4ulRNA 样品加水到 lml。(2)用 lml 水做空白。(3)把样品杯放在分光光度计比色槽上。(4)每 ul 中 DNA 或 RNA 浓度(ug)将是 OD 值的 10 倍，例如稀释后样品在 260nm 处 OD 值为 0.2
6、，则原DNA 或 RNA 样品浓度为 2ugul。(5)如果想要检测样品的纯度，那么还要再测一次 280nm 处 OD 值，计算二者的比率，若比率接近 2，则说明样品中核酸比较纯。若比率小于 1.6，则说明蛋白或其它吸收此波长的杂质在其中，建议再用酚氯仿抽提继以乙醇沉淀以除去杂质。(6)如果想检测样品中是否残存酚等有机杂质，那么还要测定一次 230nm 处 OD 值。二、琼脂糖电泳测量法二、琼脂糖电泳测量法 原理原理 质粒 DNA 及微量 DNA 片段的浓度可与已知浓度的 DNA 同时进行电泳，根据结合的溴化乙锭荧光强度，估计其含量。 仪器仪器 紫外透射反射分析仪(上海康华生化仪器制造厂)；电
7、泳槽；电泳梳；电泳仪。 试剂试剂 6上样缓冲液：0.25溴酚蓝；40(WV)糖。10TBE 电泳缓冲液：0.89mol/LTris-硼酸；0.02molLEDTANa2pH8.3。0.8琼脂糖：0.8琼脂糖；100mi 1TBE5mgmlEB：0.5gEB；100ml 三蒸水 操作操作 (1)用 1TBE 电泳缓冲液 0.8琼脂糖凝胶，加溴化乙锭其终浓度为 0.5ugm1。(2)加热使琼脂糖熔化均匀，取出室温冷却至 50-60。(3)取一块 57cm 玻璃板，置水平台上，放一微型点样梳，点样梳底部离玻璃平板的距离为 0.5-1. 0mm。(4)将凝胶小心倒在玻璃板上，待冷却后取出点样梳，保持点
8、样孔的完好。(5)取 DNA 样品及),DNA 标准浓度各 lul 加入 1TBE4ul，加入 6上样缓冲液 lul，混匀。(6)在 0.8琼脂糖凝胶点样孔小心点样，记录样品点样次数与点样量。(7)打开电源开关，电压不超过 5Vcm，一般 40V，30-40 分钟。 (8)取出泳动后的凝胶板，翻转玻璃盖在紫外分析仪观察 DNA 区带。(9)DNA 含量的估计：比较待测 DNA 的条带与已知 DNA 的各条带的荧光密度，估计待测 DNA 在凝胶中的含量，再估计出其浓度。那要看你用什么方法测定 DNA 和 RNA： （1）紫外吸收法也就是测量 OD（260）和 OD（280）的吸收值，这样的方法其
9、它的杂质对测量结果影响大一点，因为其它杂质在这两个吸收波长也有吸收。 （2）荧光法，用 PicoGreen 荧光染料，测定 DNA，RNA 浓度比较灵敏，并且适合测量低浓度和微量DNA 和 RNA，并且受其它杂质的影响不大，缺点要有专门的荧光检测仪器，试剂比较昂贵。 纯化 DNA 可以买试剂盒，主要有膜吸附法，磁珠分离法，都很方便。RNA 与 DNA 最重要的区别一是 RNA 只有一条链，二是它的碱基组成与 DNA 的不同，RNA 没有碱基T（胸腺嘧啶），而有碱基 U（尿嘧啶）。所以导致他们有以下性质上的不同。 1.两性解离：DNA 无，只有酸解离，碱基被屏蔽（在分子内部形成了 H 键）。RN
10、A 有，有 PI。 2.粘度大：DNA;RNA，粘度由分子长度/直径决定，DNA 为线状分子，RNA 为线团。 3.碱的作用：DNA 耐碱 RNA 易被碱水解。 4.显色反应： 鉴别 DNA 和 RNA+浓 HCl RNA - 绿色化合物 DNA - 蓝紫色化合物苔黑酚 二苯胺啡啶溴红（荧光染料）和溴嘧啶都可对 DNA 染色，原理是卡在分子中，DNA 的离心和电泳显色可用它们。 DNA 和 RNA 的鉴别染色 利用吖啶橙的变色特性可鉴别 DNA 和 RNA。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定，非固定细胞核酸，或作溶酶体的一种标记。观察死亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体。虽
11、然测定DNA 和 RNA 含量时较难获得好的重复性结果，但该方法已被许多实验室广泛采用。 5.溶解性：都溶于水而不溶于乙醇，因此，常用乙醇来沉淀溶液中的 DNA 和 RNA。DNA 溶于苯酚而RNA 不溶，故可用苯酚来沉淀 RNA。 6.紫外吸收：核酸的 m260nm，碱基展开程度越大，紫外吸收就越厉害。当 A1 时，DNA：50ug/ml，RNA 和单链 DNA：40ug/ml，寡核苷酸：20ug/ml。用 A260/A280 还可来表示核酸的纯度。 7.沉降速度：对于拓扑异构体（核苷酸数目相同的核酸），其沉降速度从达到小依次为：RNA ; 超螺旋DNA 解链环状 DNA ; 松弛环状 DN
12、A ; 线形 DNA 也就是在离心管中最上层是线形 DNA，最下面是RNA。 8.电泳：核苷酸、核酸均可以进行电泳，泳动速度主要由分子大小来决定，因此，电泳是测定核酸分子量的好方法。 9.DNA 分子量测定最直接的方法：用适当浓度的 EB（溴嘧啶）染色 DNA，可以将其他形式的 DNA 变成线形 DNA，用电镜测出其长度，按 B-DNA 模型算出 bp 数，根据核苷酸的平均分子量就可计算出 DNA的分子量。 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是 80 年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点
13、；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一 DNA 片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的 DNA 供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR 几小时便可完成。PCR 技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 PCR 技术简史 PCR 的最早设想 核酸研究已有 100 多年的历史，本世纪 60 年代末、70 年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana 于 1971 年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过 DNA 变性，与合适的引物杂交，用DNA 聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆 t
14、RNA 基因”。 PCR 的实现 1985 年美国 PE-Cetus 公司人类遗传研究室的 Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于 DNA 的体内复制，只是在试管中给 DNA 的体外合成提供以致一种合适的条件-摸板 DNA，寡核苷酸引物，DNA 聚合酶，合适的缓冲体系，DNA 变性、复性及延伸的温度与时间。 PCR 的改进与完善 Mullis 最初使用的 DNA 聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段，其缺点是：Klenow 酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要重新加。引物链延伸反应在 37下进行，容易发生模板和引物之 间的碱基错配，其 PC
15、R 产物特异性较差，合成的 DNA 片段不均一。此种以 Klenow酶催化的 PCR 技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于 Klenow 酶不耐热，在 DNA 模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给 PCR 技术操作程序添了不少困难。这使得 PCR 技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988 年初，Keohanog 改用 T4 DNA 聚合酶进行 PCR，其扩增的 DNA 片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种 DNA 片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988 年 Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus a
16、quaticus) 中提取到一种耐热 DNA 聚合酶。此酶具有以下特点：耐高温，在 70下反应 2h 后其残留活性大于原来的 90%，在 93下反应 2h 后其残留活性是原来的 60%，在 95下反应 2h 后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效 率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶 I Klenow 片段区别，将此酶命名为 Taq DNA 多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR 广泛的被应用。 PCR 技术基本原理 PCR 技术的基本原理 类似于 DNA 的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加
