发光免疫检测技术的临床应用 及其应注意的问题杨晓林 博士北京大学医学部研究员 中国生物物理学会光生物学专业委员会副主任委员 国际生物发光和化学发光学会( ISBC）学术理事 Council member of scientific advisory board of International Society on Bioluminescence & Chemiluminescence²²由于化学反应（通常是氧化）产生电子能级处于由于化学反应（通常是氧化）产生电子能级处于 激发态的物质，后者通过跃迁释放能量产生光子激发态的物质，后者通过跃迁释放能量产生光子 ，从而导致的发光现象从而导致的发光现象化学发光化学发光 （ （ChemiluminescenceChemiluminescence） ）²²生物发光和化学发光均属于冷光，即发光不是由于生物发光和化学发光均属于冷光，即发光不是由于 发光体温度升高所至，发射波长也与其温度无关发光体温度升高所至，发射波长也与其温度无关按化学反应类型按化学反应类型 化学发光的分类化学发光的分类²² 酶促化学发光：酶促化学发光：辣根过氧化物酶系统辣根过氧化物酶系统碱性磷酸酶系统碱性磷酸酶系统黄嘌呤氧化酶系统黄嘌呤氧化酶系统²² 非酶促化学发光：非酶促化学发光：吖啶酯系统吖啶酯系统草酸酯系统草酸酯系统三价铁三价铁- -鲁米诺系统鲁米诺系统²²闪光（闪光（FlashFlash））: : 按发光持续时间按发光持续时间发光时间在数十分钟以上，如：发光时间在数十分钟以上，如： HRP-HRP-LuminolLuminol系统系统AP-AMPPDAP-AMPPD系统系统黄嘌呤氧化酶系统黄嘌呤氧化酶系统无须原位进样、无须原位进样、 以速率法测量。
以速率法测量发光时间在数秒内，如吖啶酯发光时间在数秒内，如吖啶酯以原位进样以原位进样( (In Situ Injector) In Situ Injector) 和时和时间积分法测量间积分法测量²²辉光（辉光（GlowGlow））: :时间时间发光信号发光信号辉光坪区辉光坪区速率法测量速率法测量原位进样原位进样积分法测量积分法测量闪光尖峰闪光尖峰闪光与辉光及其测量方式的差别闪光与辉光及其测量方式的差别鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统HH2 2OO2 2+ +NHNH2 2OOOONHNHNHNHN N2 2OHOH- -HRPHRPNHNH2 2COCO2 2- -COCO2 2- -+Photon (425nm)+Photon (425nm)R ROHOHR ROHOHN NS SR RB BOHOHOHOH增强剂增强剂（（EnhancerEnhancer））商业化产品中常见的化学发光系统商业化产品中常见的化学发光系统AMPPDAMPPD及其衍生物及其衍生物的化学发光系统的化学发光系统+ +* *光子光子(477(477nm)nm)APAPOOOOOCHOCH3 3OPOOPO3 32-2-OO- -OOOOOCHOCH3 3OOOO- -OOOCHOCH3 3商业化产品中常见的化学发光系统商业化产品中常见的化学发光系统CHCH3 3C=OC=O OOR RN N+ +OHOH- -HH+ +HH2 2OO2 2+ H+ H2 2OO+ +R ROHOH光子光子 + + COCO2 2 + +CHCH3 3C=OC=O OOR RN NHOHOCHCH3 3C=OC=O OOR RN NHOOHOOCHCH3 3OON NCHCH3 3OON NC=OC=OOO商业化产品中常见的化学发光系统商业化产品中常见的化学发光系统吖吖 啶啶 酯酯 化化 学学 发发 光光 系系 统统发光信号检测发光信号检测光敏二极管、光敏电池、光电偶合器（光敏二极管、光敏电池、光电偶合器（CCDCCD））²²结构简单、性能稳定结构简单、性能稳定 ²²但灵敏度低、线性范围较窄。
但灵敏度低、线性范围较窄主要特点主要特点原理原理光信号光信号光电转换器件光电转换器件电压或电流信号电压或电流信号放大放大单光子计数器是目前高灵敏度单光子计数器是目前高灵敏度 发光分析仪的核心部件发光分析仪的核心部件光电倍增管光电倍增管高压高压高速放大器高速放大器高速比较器高速比较器高速分频器高速分频器发光样品发光样品 产生光子产生光子激发光阴极激发光阴极 产生光电子产生光电子在阳极上形在阳极上形 成较强信号成较强信号脉冲信号脉冲信号相对发光单位相对发光单位 数字脉冲数字脉冲( (RLU)RLU)在各打拿极之间得到在各打拿极之间得到 能量和数目的倍增能量和数目的倍增单光子计数式发光检测仪单光子计数式发光检测仪计计 算算 机机打打 印印 机机发光仪控制模块发光仪控制模块发光仪执行模块发光仪执行模块控制器控制器程控高压程控高压计数计数/ /贮存器贮存器单光子计数器单光子计数器样品运动样品运动/ /定位装置定位装置程控自动门锁及检测装置程控自动门锁及检测装置原位注射泵原位注射泵光生物学技术的应用范围光生物学技术的应用范围²²军事侦测军事侦测 ²²公安稽查公安稽查 ²²卫生检疫卫生检疫 ²²药物筛查药物筛查 ²²医学诊断医学诊断 ²²环境检测环境检测 ²²航天遥感航天遥感 ²²生命科学生命科学 ²²…… …… 已成为现代生物技术最活跃的领已成为现代生物技术最活跃的领 域之一域之一光生物学检测技术的优越性光生物学检测技术的优越性²²彻底消除了放射性危害彻底消除了放射性危害²²无半衰期限制，试剂稳定无半衰期限制，试剂稳定 性和有效期大大延长性和有效期大大延长 ²²容易实现连续、动态、重容易实现连续、动态、重 复测定复测定²²适合于复合标记系统进行多指适合于复合标记系统进行多指 标并行测定标并行测定 ²²操作简单，反应速度快，容易操作简单，反应速度快，容易 实现自动化实现自动化 ²²灵敏度和线性范围超过以往技灵敏度和线性范围超过以往技 术术几种标记几种标记/ /检测技术灵敏度的比较检测技术灵敏度的比较酶标酶标荧光荧光放免放免发光发光灵敏度灵敏度( (mol/L)mol/L)1010-18-181010-15-151010-12-121010-9-9几种标记几种标记/ /检测技术线性范围的比较检测技术线性范围的比较酶标酶标荧光荧光放免放免发光发光线性范围线性范围10105 510104 410103 310102 2几种标记几种标记/ /检测试剂的有效期比较检测试剂的有效期比较酶标酶标荧光荧光放免放免发光发光有效期（月）有效期（月）1818151512129 96 63 30 0020,00040,00060,00080,000100,000试剂盒仪器特殊防护治理污染人民币人民币三种免疫测定技术的成本及费用三种免疫测定技术的成本及费用三种免疫测定技术的成本及费用放免放免酶标酶标发光发光²²抗原：可诱导动物免疫系统产生免疫应答的物质。
抗原：可诱导动物免疫系统产生免疫应答的物质²²抗体：由动物免疫系统产生，可特异性结合某种物抗体：由动物免疫系统产生，可特异性结合某种物质的球蛋白质的球蛋白 免疫分析技术基本原理免疫分析技术基本原理利用抗原、抗体之间的特异性结合来测定、分析特定物质的方法利用抗原、抗体之间的特异性结合来测定、分析特定物质的方法免疫测定技术分类免疫测定技术分类反应结束后是否需要分离反应结束后是否需要分离均相法均相法 （（HomogeneousHomogeneous））非均相法非均相法 （（HeterogeneousHeterogeneous））均相法均相法（ （HomogeneousHomogeneous） ）²²免疫凝集法：免疫凝集法：自然凝集：血型测定自然凝集：血型测定肥达氏反应；肥达氏反应；敏化凝集：血球凝集法敏化凝集：血球凝集法凝胶（微粒）比浊法凝胶（微粒）比浊法²²免疫扩散法；免疫电泳法近场液闪法，免疫扩散法；免疫电泳法近场液闪法，²²酶酶-- --辅酶（亚基）配位法辅酶（亚基）配位法²²荧光偏振法，荧光共振法荧光偏振法，荧光共振法²²吖啶酯水解法，生物传感器吖啶酯水解法，生物传感器非均相法非均相法（ （HeterogeneousHeterogeneous） ）²²免疫印迹（免疫印迹（Western-blotWestern-blot）：）：基因表达分析、基因表达分析、HIVHIV感染确认实验感染确认实验²²免疫组织化学技术：原位基因表达分析、临床病理学分析免疫组织化学技术：原位基因表达分析、临床病理学分析²²纸片法：早孕快速检测、吸毒检测快速、献血快速检测纸片法：早孕快速检测、吸毒检测快速、献血快速检测²²放射免疫法（放射免疫法（RIARIA）：）：沉降法（放免）、固相法（免放，沉降法（放免）、固相法（免放，IRMAIRMA））²²荧光免疫法（荧光免疫法（FIAFIA）；）；酶联免疫法（酶联免疫法（EIAEIA，，ELISAELISA））²²酶联荧光法（酶联荧光法（FEIAFEIA）、）、化学发光法（化学发光法（LIALIA））²²酶联化学发光法（酶联化学发光法（ELIAELIA）、）、时间分辨荧光法（时间分辨荧光法（DELFIADELFIA）、）、电化电化学发光法（学发光法（ECLIAECLIA）；）；…………双抗体夹心法（三明志法）原理双抗体夹心法（三明志法）原理固相支持物表面固相支持物表面包被抗体包被抗体标记抗体标记抗体待测物待测物夹心法的剂量夹心法的剂量----反应关系曲线反应关系曲线信号强度（信号强度（Y Y））线性范围线性范围待测物浓度（待测物浓度（X X））Hook(Hook(前滞前滞) )效应效应分析灵敏度（最低检测限）（分析灵敏度（最低检测限）（95%95%可信度）：可信度）：S0S0+ +2SD2SD在该曲线上所对应的浓度值。
在该曲线上所对应的浓度值 功能灵敏度：功能灵敏度：测定误差（变异）测定误差（变异）≤≤20%20%的最低可检测浓度的最低可检测浓度 线性范围：线性范围：（分析）（分析）功能灵敏度功能灵敏度------变异变异≤≤20%20%的最高检测浓度的最高检测浓度 相关系数相关系数≥≥0.990.99的曲线范围的曲线范围竞争法的原理竞争法的原理固相支持物表面固相支持物表面待测物待测物包被抗体包被抗体标记抗原标记抗原竞争法的剂量竞争法的剂量----反应关系曲线反应关系曲线待测物浓度（待测物浓度（ X X ））信号强度（信号强度（ Y Y ））线性范围线性范围分析灵敏度（最低检测限）（分析灵敏度（最低检测限）（95%95%可信度）：可信度）：S0-2SDS0-2SD在该曲线上所对应的浓度值在该曲线上所对应的浓度值 功能灵敏度：功能灵敏度：测定误差（变异）测定误差（变异）≤≤20%20%的最低可检测浓度的最低可检测浓度 线性范围：线性范围：（分析）（分析）功能灵敏度功能灵敏度------变异变异≤≤20%20%的最高检测浓度的最高检测浓度 相关系数相关系数≥≥0.990.99的曲线范围的曲线范围间接法原理间接法原理包被体包被体待测抗体待测抗体包被抗原包被抗原标记抗体标记抗体 （（二抗）二抗）俘获法原理俘获法原理俘获抗体俘获抗体 （二抗）（二抗）待测抗体待测抗体标记抗原标记抗原包被体包被体双抗原夹心法原理双抗原夹心法原理包被体包被体待测抗体待测抗体包被抗原包被抗原标记抗原标记抗原间接包被夹心法原理间接包被夹心法原理 。