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1、第三节 Oxidative phosphorylation一. 氧化磷酸化的机理What is oxidative phosphorylation氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）是指细胞内伴随有机物氧化，利用生物氧化过程中释放的自由能，促使ADP与无机磷酸结合生成ATP的过程。 ？一. 氧化磷酸化的机理20世纪30年代包括德国生物化学家、诺贝尔奖获得者Meyerhof & Warburg在内的许多生化学家对代谢过程中能量的产生和利用作了深入研究，发现无论在糖酵解或三羧酸循环等代谢过程中，都有伴随着ATP磷酸根的放出或 ADP得到磷酸根的变化这类化学能量高效率的传
2、递方式，指出腺苷三磷酸（ATP）是代谢中能量产生和利用的关键化合物。 一. 氧化磷酸化的机理1941年Fritz Lipmann引入“高能磷酸键 (P)”的概念。1949年美国生化学家Eugene Kennedy和Albert Lehninger发现线粒体含有三羧酸循环和呼吸链所需要的全部酶系统，并且发现生物氧化与ADP磷酸化相偶联构成了氧化磷酸化。但是，NADH的氧化和电子传递过程是如何与ADP磷酸化生成ATP反应偶联起来一直不清楚。 一. 氧化磷酸化的机理关于这一问题目前至少有三种假说 比较著名的假说有三个：化学偶联假说构象偶联假说化学渗透学说目前得到公认的是“化学渗透学说”。 这个假说是
3、1953年由Edward Slater最先提出。 假说认为在NADH氧化和电子传递过程中产生了一种活泼的高能共价中间物，通过此中间物进一步氧化产 生的能量来驱动ATP的合成。这一假说完全是依据底物 水平磷酸化机理提出的，例如在糖酵解中，由3-磷酸甘油醛脱氢酶催化的反应就产生了一种活泼且具有高 能磷酸基转移势能的酰基磷酸化合物1，3-二磷酸甘油，随后其分子中的高能磷酸基团在磷酸甘油酸激酶的 作用下被转移到ADP生成ATP。虽然在糖酵解过程中存在这种例证，但是人们至今未能在线粒体中分离到与 之相类似的高能共价中间物。 化学偶联假说 Chemical coupling hypothesis这个假说是
4、1964年由P.D.Boyer提出。该假说认为作为电子传递体的蛋白质有两种不同的构象：低能构象和高能构象。电子传递的结果使低能构象转变为高能构象，后者再将能量传递给F0-F1-ATP合成酶，使之也发生构象变化，从而推动ADP磷酸化形成ATP。这种假说有一定的实验根据，在电子沿呼吸链流动时，观察到线粒体内膜发生迅速的物理变化，但由于测定构象比较困难，支持这个假说的实验太少。构象偶联假说 Conformational coupling hypothesis 英国生物化学家Peter D Mitchell在1961年提出化学渗透假说，由于该假说提出后逐渐拥有越来越多的实验证据，因而成为目前解释氧化磷
5、酸化偶 联机理最为公认的一种假说，并且Peter Mitchell因提出该假说而获得了1978年的诺贝尔化学奖。 化学渗透学说 Chemiosmotic hypothesis电子传递体在线粒体内膜上有着不对称分布，传氢体和传电子体交替排列，催化是定向的；Chemiosmotic hypothesiskey points一. 氧化磷酸化的机理复合物I、III、IV将H+从基质内泵向内膜的外侧，而将电子传向其后的电子传递体；化学渗透学说一. 氧化磷酸化的机理内膜对质子不具有通透性，这样在内膜两侧形成质子浓度梯度，这就是推动ATP合成的原动力；化学渗透学说一. 氧化磷酸化的机理当存在足够高的跨膜质子
6、化学梯度时，强大的质子 流通过F1-F0-ATPase进入基质时，释放的自由能推动ATP合成。 化学渗透学说一. 氧化磷酸化的机理The reconstituted vesicles containing ATP synthase and bacteriorhodopsin, a light-driven proton pump, reported by Efraim Racker and Walther Stoeckenius in 1974化学渗透学说(min)0306090120A 492-0,06-0,04-0,020,000,02ATPGramicidinAOADP + PAOH+
7、AOH+ATPi一. 氧化磷酸化的机理F1：球形头部，伸入线粒体基质，由五种亚基组成33 ,是ATP合酶的催化部分；F0: 横贯线粒体内膜，含有质子通道，由十多种亚基组成。位于F1与F0之间的柄含有寡霉素敏感性蛋白。 F1-F0-ATPase复合物一. 氧化磷酸化的机理由上述化学渗透假说可知，该模型必需具备两个条件：一是线粒体内膜必须是质子不能透过的封闭系统，否则质子梯度将不复存在；二是要求呼吸链和ATP合酶在线粒体内膜中定向地组织在一起，并定向地传递质子、电子和进行氧化磷酸化反应。 重 要一. 氧化磷酸化的机理目前这两方面都获得了一些实验证据，例如能携带质子穿过线粒体内膜的物质（如2,4-二
8、硝基苯酚）可破坏线粒体内膜对质子的透性壁垒，使质子电化学梯度消失。另外根据测算，膜间隙的pH较内膜低1.4个单位，并且线粒体内膜两侧原有的外正内负跨膜电位升高。 重 要一. 氧化磷酸化的机理F1-F0-ATPase复合物P/O(磷氧比)：在生物氧化过程中，伴随ADP磷酸化所消耗的无机磷酸的磷原子数与消耗的分子氧的氧原子数之比。即每消耗1个氧原子所产生的ATP的分子数。 二. 氧化磷酸化的P/O比测定结果表明：NADH经呼吸链完全氧化时，P/O为 3，即1分子的NADH通过呼吸链将电子最终传递给O2可产生 3 个ATP ；二. 氧化磷酸化的P/O比二. 氧化磷酸化的P/O比FADH2经呼吸链完全
9、氧化时，P/O为 2，即1分子的FADH2通过呼吸链将电子最终传递给O2可 产生 2 个ATP。为什么？二. 氧化磷酸化的P/O比为什么？二. 氧化磷酸化的P/O比但是, 近年来很多实验结果都证明，以NADH作为电子供体时，测得的P/O比值大于2。以琥珀酸作为电子供体时，侧得的P/O比值大于1；所以P/O比值不一定是整数。例如，-羟丁酸经过NADH途径的P/O比值为2.42.6，产生的ATP数目为2.5；而琥珀酸经过FADH2的P/O比值为1.7，产生的ATP数目为1.5。 二. 氧化磷酸化的P/O比因此，虽然电子转移伴随着ATP的合成，但不能仅以P/O比值作为ATP生成数的依据，而应考虑一对
10、电子从NADH或FADH2传递到氧的过程中，有多少质子从线粒体基质泵出，以及有多少质子必须通过ATP合酶返回基质以用于ATP的合成，这样才能从本质上确定ATP的生成数量。 二. 氧化磷酸化的P/O比目前被广泛接受的观点是：ATP、ADP和无机磷酸通过线粒体内膜的转运是由ATP-ADP载体和磷酸转位酶催化的。已知每合成1个ATP需要3个质子通过ATP合酶。与此同时，把一个ATP分子从线粒体基质转运到胞液需要消耗1个质子，所以每形成1个分子的ATP就需要4个质子的流动。因此，如果一对电子通过NADH电子传递链可泵出10个质子，则可形成2.5 个分子ATP；如果一对电子通过FADH2电子传递链有6个
11、质子泵出，则可形成1.5个ATP分子。 三. ATP酶-构象偶联假说 该假说是 1964年由美国生物化学家Paul Boyer最先提出，他认为电子传递过程中，线粒体内膜上的蛋白质组分发生了构象变化，转变成一种高能形态。这种高能形态通过将能量转移到ADP合成ATP后，又得以恢复其原来的构象。随着人们对ATP合酶结构的研究和认识不断深入，在构象偶联假说的基础上形成了ATP合酶结合变化和旋转催化假说。 三. ATP酶-构象偶联假说 ATP合酶结合变化和旋转催化假说认为，ATP合酶与底物核苷酸的作用是按照结合变化机理进行的。构成ATP合酶头部的33亚基构成3个催化部位，中部的亚基在质子推动力的驱动下相
12、对于33作旋转运动。由于3个亚基与亚基的不对称接触，使其分别处于三种不同的状态，即无核苷酸结合的空置状态（O）、结合ADP+Pi的松散结合状态（L）和结合ATP的紧密结合状态（T）。 Rotation of leads to sequential binding changes for each subunit.三. ATP酶-构象偶联假说 当质子推动力驱使H+经F0质子通道进入时，F0组分质子化而发生构象改变，积累足够的扭矩力，推动相对33旋转120，使处于T态的催化部位释放ATP变成O态，同时L态催化部位上生成ATP变为T态，O态结合ADP+Pi变为L态 BoyerThe binding-
13、change model was elegantly supported by two other experimental observations X-ray crystallography revealed that the three subunits of F1 assumes three different conformations, with bound ADP, ATP analog, or empty respectively. Rotations of the subunit and the c -ring of the F1 unit in three discrete
14、 steps of 120o (as being powered by ATP hydrolysis catalyzed by the subunits) have been directly observed using fluorescence microscopy (1997)Rod-shaped subunit.ADPApp(NH)pEmptyStructure determination indicates that indeed the three subunits are inequivalent in conformation! (John Walker, 1994)T (ti
15、ght)L (loose)O (open)Rotation of the subunit and the ring of c subunits in the FoF1 complex was observed by in vitro studies using fluorescence microscopy (K. Kinosita, 1997)33, with the subunit linked to an actin filament will also rotate when ATP is added.Fluorescencetly labeledThe worlds smallest
16、 molecular motor: rotational catalysis.Model on the rotation of the c-ring in ATP synthase: two half-channels for H+ on the a subunit has been proposed.(3ATP made per 10-14 protons transported: 3H+/ATP.)Asp1. 解偶联剂解偶联剂（uncoupler）是指那些不阻断呼吸链的电子传递，但能抑制ADP通过磷酸化作用转化为ATP的化合物。它们也被称为氧化磷酸化解偶联剂。最早发现的一个解偶联剂是2, 4-二硝基苯酚（2, 4-dinitrophenol
