食品微生物检验学实验

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1、1微生物检验学微生物检验学教学实验教学实验通过教学实验，了解食品检验中微生物检测部分的基本方法，要求学生通过实践操作的训练，掌握食品检验中微生物检测技术的基本操作技能。熟练掌握培养基配制、高压蒸汽灭菌技术、无菌操作技术和菌数计数、生化鉴定等技术，使学生具有较强的实际操作能力。【目的要求】1.熟练掌握培养基制备与灭菌、无菌操作技术2.掌握细菌菌落计数方法3.掌握大肠菌群的识别与分离技术【实验内容】1 培养基制备与灭菌2 水质的取样和制备（无菌操作技术）3 细菌菌落总数的计数与结果分析4 大肠菌群的初发酵试验与分离培养5 大肠菌群的革兰氏染色、复发酵试验和结果分析【实验方法】一、培养基制备与灭菌1

2、.学生分为若干组，每组配备一套培养基、并经高压锅蒸汽灭菌。2.学生独立完成玻璃器皿的包扎和干热灭菌 二、水样的采集与制备 1采集实验室的自来水样 2采集自来水制备的水源水（闽江水）和校内观音湖水样 三、细菌菌落总数测定（标准平板活细胞计数法，SPC） 1.水样的稀释、制备和培养 2.细菌菌落计数方法3.细菌菌落计数的报告四、大肠菌群检验： 1.生活饮用水或食品厂生产用水的检验 2.水源水（闽江水）和校内观音湖水水样 （1）初步发酵试验（2）分离培养（3）证实试验（4）根据证实为大肠菌群阳性的管数，查表计算出大肠菌群最可能数。 五、写出水质检验的结果，并评价所检测的水质质量状况。2水质卫生检验水

3、质卫生检验一、水样的采集一、水样的采集 1.自来水 先将水龙头用清洁布拭干，并用摄子夹消毒棉花沾酒精灼烧水龙头 3min 灭菌， 再打开水龙头使水流 5min 后，以灭菌的三角瓶或生理盐水瓶接取水样，以待检测。2.池水、河水或湖水 应取距水面 1015cm 的深层水，先将灭菌的带塞的玻璃瓶瓶口向下浸入水中， 然后翻转过来，除去瓶塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞塞好，再从水中取出， 最好立即检验，否则需放入冰箱保藏。 二、细菌菌落总数测定（二、细菌菌落总数测定（SPCSPC） 1.样品稀释与制备 （1）自来水：自来水：用灭菌吸管吸取 1mL 水样，注入灭菌的培养皿中，共做两个平 皿。然后倒入约

4、15 mL 已溶化并冷却至 45左右的营养琼脂培养基，并轻轻摇晃， 使水样与培养基充分混匀。待冷却后倒置于 361培养 24h，进行菌落计数。 （2）池水、河水或湖水等：池水、河水或湖水等：用无菌吸管吸取检测水样 1mL 于第一支 9mL 生理 盐水试管中，摇匀，再从第 1 支稀释试管中吸取 1mL 于第 2 支生理盐水的试管中， 如此类推，做成一系列的稀释液。一般稀释度可选择为 10-1、10-2、10-3、10-4，若 水样混浊或污染严重的可再进一步稀释至适宜稀释度。自最后三个稀释度的试管 中各吸取 1mL 稀释液于培养皿中，每稀释度做二个平皿，倾注入约 15mL 已溶化并 冷却至 45左

5、右的营养琼脂，并轻晃平皿，使之混匀，待冷却后倒置于 361 培养箱中培养 24h。 2.菌落计数方法待平皿培养 24h 长出菌落后作平皿菌落计数，可用肉眼观察，必要时用放大 镜检查，以防遗漏，在记下各皿的菌落数后，求出同稀释度的 2 个平皿的平均菌 落数。3.菌落计数的报告：平皿菌落数的选择：选取菌落数在 30300 之间的平皿作为菌落总数测定 标准，一个稀释度使用两个平皿应采用其平均数，其中一个平皿有较大片状菌落 生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数，若 片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可计算半个平皿 后乘 2 以代表全皿菌落数。 稀释度

6、的选择： a.应选择平均菌落数在 30300 之间的稀释度，乘以稀 释倍数报告之(见表例 1)。 b.若有两个稀释度，其生长之菌落数均在 30300 之间，则应视二者之比如 何来决定，若其比值小于 2，应报告其平均数：若大于 2 则报告其中较小的数字 (见表例 2 及 3)。 c.若所有稀释度的平均菌落数均大于 300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘 以稀释倍数报告之(见表例 4) d.若所有释稀度的平均菌落数均小于 30，则应按稀释倍数最低的平均菌落数 乘以稀释倍数报告之(见表例 5)。 e.若所有稀释度的平均菌落数均不在 30300 之间，其中一部分大于 300 或3小于 30 时，则以最

7、接近 30 或 300 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表例 6)。f.若所有稀释度均无菌落生长，则以小于()1 乘以最低稀释倍数报告之(见 表例 7)。细菌菌落总数计算方法（细菌菌落总数计算方法（SPCSPC 法）法） 不同稀释度平均 CFU例 次10-110-210-3两稀释度 CFU 之比菌落总数报告CFU/mL(g)备 注113561642016400 或 1.6X10422760295461.637750 或 3.8X10432890271602.227100 或 2.7X104430001650513513000 或 5.1X105527115270 或 2.7X1026无法计数

8、3051230500 或 3.5X104两位以后 的数字采 用四舍五 入的方法 去舍。700010菌落数的报告：菌落数小于 10，按10 报告；在 100 以内时，按其实有数 报告；大于 100 时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五 入方法计算，为了缩短数字后面的零数，也可用 10 的指数来表示。三、大肠菌群检验：三、大肠菌群检验：大肠菌群系指一群在 36124h 能发酵乳糖产酸、产气，需氧和兼性厌氧 G- 无芽孢杆菌，包括埃希氏大肠杆菌、克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌和柠檬酸杆菌等。 该菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价水质的卫生质量， 具有广泛的卫生学意义。

9、水中大肠菌群数系以每 1L 水样中大肠菌群最近似数(M.P.N)个表示。 瓶装水、饮用水、水源水和游泳池水卫生标准瓶装水、饮用水、水源水和游泳池水卫生标准 水 源大肠菌群 (个/L)CFU/mL 瓶装水（矿泉水、纯净水）250饮用（自来）水2100准备加氯消毒后供饮用的水1000水源水准备净化处理及加氯消毒后供饮用的水10000 游泳池水1001000 1. 生活饮用水或食品厂生产用水的检验生活饮用水或食品厂生产用水的检验： （1）初步发酵试验 在 2 个各装有 50mL 叁倍浓缩的十二烷基硫酸钠乳糖蛋白胨发酵管中，各加 入 100 mL 水样，将 10 支含有 5mL 叁倍乳糖蛋白胨发酵管中

10、各加入 10mL 水样，于 361培养 24h，24h 未产气者继续培养至 48h。若水质条件变化不大的饮用水 （或生产用水）可采用 3 个装有 50mL 叁倍浓缩的十二烷基硫酸钠乳糖蛋白胨发酵 管分别加入 100mL 水样。（2）分离培养 将产气的发酵管分别接种在伊红美兰琼脂平板，置 361培养 1824h，然 后取出，观察菌落形态，凡菌落或菌苔符合深紫黑色，有金属光泽；紫黑色，不 带或略带金属光泽；淡紫红色，中心颜色较深或紫红色菌落特征的均应进一步作 革兰氏染色和证实试验。4（3）证实试验 在上述平板上，挑取在此平板生长符合上述特征的菌落，或可疑无法判断的 菌落 12 个进行革兰氏染色，同

11、时接种乳糖发酵管，置 361培养 242h， 观察产气情况，凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告 为大肠菌群阳性；如乳糖发酵管不产气或革兰氏染色阳性，则报告为大肠菌群阴 性。 （4）根据证实为大肠菌群阳性的管数，查下列表。 饮用水大肠菌群检索表（接种水样总量饮用水大肠菌群检索表（接种水样总量 300300mL，其中，其中 100100mL2 2 份，份，1010mL1010 份）份）0 1 2100mL水样阳性管数10mL水样阳性管数 个/L个/L个/L0341113818271327311183841424525183070622369272743120831511619

12、3660230104069230 大肠菌群变异不大的饮用水检索表大肠菌群变异不大的饮用水检索表 阳性管数0123 1L 水样中大肠菌群数341118接种水样总量 300mL（ 3 份 100mL） 2池水、河水或湖水等水源水的检验池水、河水或湖水等水源水的检验 将水样稀释成 10-1、10-2。分别吸取 1mL 的 10-1、10-2的稀释水样和 1mL 原水 样，各注入装有 10mL 单料乳糖蛋白胨发酵管中，另取 10mL 原水样注入装有 5mL 叁倍十二烷基硫酸钠乳糖蛋白胨发酵管中（接种水量为 11.11mL，若水源水严重污 染则取样量应为 1.111mL，即原水样、10-1、10-2、1

13、0-3；若污染轻度水取样为 111.1mL，即 100 倍原水样、10 倍原水样、原水样和 10-1） 。置 361培养 242h，观察产气情况，若有产气者则按上述的分离培养与证实试验进行，最后 根据产气管数查表报告。 四、培养基配方四、培养基配方： （1）生理盐水 NaCl 9g 水 1000mL （2）伊红美兰培养基（EMB） 蛋白胨水琼脂培养基 100mL （蛋白胨 10g NaCl 5g 琼脂 20g 水 1000mL pH7.6 12120min）乳糖 2g 2%伊红液 2mL 0.65%美兰液 1mL 将已灭菌的蛋白胨水琼脂溶化，冷却至 60左右时，按无菌操作加入乳糖、 伊红液和美

14、兰液（这三种应分别在 115灭菌 20min） ，摇匀后倒平板。 （3）乳糖发酵液（供复发酵用）蛋白胨 10g 乳糖 5g NaCl 5g 水 1000mL pH7.45（4） 营养琼脂 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g NaCl 5g 琼脂 20g 水 1000mL pH7.0-7.2 121 20min。 （5）单料十二烷基硫酸钠乳糖发酵液配方： 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 乳糖 5 g NaCl 5g 1.6%溴甲酚紫乙醇液 1mL 十二烷基硫酸钠 0.1g水 1000mL pH7.27.4 将上述除指示剂外溶于水，调 pH7.27.4，再加入指示剂。 （6）叁料十二烷基硫酸钠乳糖发酵液配方： 按单料十二烷基硫酸钠乳糖发酵液配方要求各营养成分为叁倍，而加水不变。水源水大肠菌群检索表水源水大肠菌群检索表接种水量接种水量 11.1111.11mL，分别为，分别为 1010、1 1、0.10.1 和和 0.010.01mL各各 1 1 份份接种水样/mL 1010.10.01每 L 水样中大 肠菌群数9090 90 95 180 190 220 230 280 920 940 1800 2300 9600 23800 23800若接种水量为 111.1mL则上述数字减少 10 倍，若接种水量为 1.111mL则上述数字增加 10 倍。