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1、实验五 人类淋巴细胞株培养培养基的配制一、实验目的v熟练掌握RPMI 1640培养基的配制方法。二、实验原理v 细胞培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基 有商品出售，它是根据细胞生长的需要按 一定配方制成的粉状物质。其主要成分是 氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子 和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与 活体内细胞外液相似。v小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是 它含有细胞生长所必需的生长因子；酶、微 量元素和激素；保护作用；提供伸展和贴附 因子等，是合成培养基所无法替代的。此外 它还能中和有毒物质（重金属、抗菌素）的 毒性。小牛血清v氨基酸是组成蛋白质的基本单位
2、。不同种类的细 胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自 身不能合成，必须依靠培养基提供，这几种氨基 酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核 酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时， 细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有 较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液 中很不稳定，应置于-20冰箱中保存，在使用前加入培养液内。L-谷氨酰胺三、仪器、材料和试剂v超净工作台v高压灭菌锅v多重蒸馏水器v磁力搅拌器v天平v微量加样器（一）仪器（二）用具、材料v细胞培养瓶v量筒、研钵、烧杯、漏斗、滤纸vpH试纸v微孔过滤器（0.22m）及注射器v各种规格的Tip 、离心管（三）试剂vNaOH、
3、 酚红vRPMI 1640干粉v小牛血清、青霉素、链霉素vNaHCO3 、L-谷氨酰胺v三蒸水v要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个 基本要求：v一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的 水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其 有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意 外环境酸碱度和渗透压的调节。v二是严格控制无菌条件。 注意四、实验步骤（一）准备(清洗与灭菌） （二）合成培养基的配制1. 1%酚红：v配制 0.1 mol/L NaOH 100ml。v称量 1g 酚红于研钵中，取 30 ml 0.1 mol/L NaOH逐渐加入研钵中，尽量研细，然后过滤。v过滤后的酚红液加三蒸水至 100 ml
4、。v4保存。2. 饱和NaHCO3的配制：v称取 10g 的 NaHCO3 溶于 200 ml 三蒸水中，灭菌后分装于50 ml 试剂瓶。v4保存。3RPMI 1640 培养液配制：配制50ml RPMI 1640培养液：v每组称取 RPMI 1640干粉 0.52g，溶于50 ml 的三蒸水。v置于搅拌器上搅拌 20 min，直到液体变为澄清为止。磁珠4. RPMI 1640 合成培养基配制：v加入 0.1ml 1%的酚红，通入CO2，使液体变为金黄色，说明培养基完全溶好。v配制好的培养基，用时用饱和 NaHCO3液 调节 pH 至 6.8-7.0。v溶好以后的培养液在超净台中进行0.22m
5、滤过除菌，分装至细胞培养瓶中。v瓶口封好，-20或4 贮存。（三）小牛血清的处理v新买的新生小牛血清一定要灭活。v将买来的新生小牛血清不开封置于水浴锅中56，30min，期间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。v处理后的血清贮存于4。（四）生长培养基的配制1双抗： （100000U/ml）v160万单位青霉素/瓶+8ml 3DW = 20万单位/mlv1g链霉素+5ml 3DW = 200000 g /mlv各取以上的液体5ml混合，使其浓度为10万单位/ml，0.22m 过滤至1.5ml离心管，-20贮存。2谷氨酰胺储备液（200mmol/L）： v1.5g的谷氨酰胺溶于50ml三蒸水中（30 mg/ml= 200 mmol/L),0.22m过滤至1.5ml离心管中。v-20贮存。3. RPMI 1640生长培养基的配制50毫升 储备液浓度终浓度RPMI 1640培养液 44.5谷氨酰胺0.530mg/ml0.3mg/ml双抗0.05100000u/ml100u/ml小牛血清510%六、思考题：v血清在细胞培养中有何作用？v为什么配制培养基之前要反复处理配制用水并要事先高压处理？v配制培养基时调节pH值的目的是什么？
