1微生物次级代谢产物生物合成基因簇与药物创新【关键词】 ,微生物次级代谢产物；,,生物合成基因簇；,, 药物创新；,,组合生物合成；,,代谢工程摘要： 微生物产生众多结构和生物活性多样的次级代谢产物，其生物合成基因簇的克隆是药物创新和产量提高的必要前提迄今为止已有超过 150 种生物合成基因簇通过各种方式被克隆，并被用于组合生物合成、体外糖类随机化、代谢工程的定向改造我们研究室已经克隆并测定了氨基糖苷类井冈霉素/有效霉素、多烯类抗生素 FR008/克念菌素、聚醚类南昌霉素、聚酮类梅岭霉素、杂合聚酮多肽类口恶唑霉素等生物合成基因簇深入的基因功能分析揭示了他们独特的生物合成途径和调节机理，为正在进行的组合生物合成结构改造和代谢工程产量提高奠定了基础关键词： 微生物次级代谢产物； 生物合成基因簇； 药物创新； 组合生物合成； 代谢工程Secondary metabolic pathway genes and new drug discoveryABSTRACT Microorganisms produce myriads of 2secondary metabolites with both structural and functional diversities. The cloning of corresponding biosynthetic gene clusters is essential for new drug discovery and yield improvement by metabolic engineering. To date, more than 150 biosynthetic gene clusters had been cloned via different strategies, which are subsequently manipulated through combinatorial biosynthesis, in vitro glycorandomization, or other biotechnological methods. In our laboratory, several biosynthetic gene clusters have been cloned and sequenced, representatives of which are responsible for the biosyntheses of the aminoglycoside jinggangmycin/validamycin, polyene antibiotic FR008/candicidin, polyether nanchangmycin, polyketide meilingmycin, PKSNRPS oxazomycin and others. Extensive analyses of gene functions, their unique biosynthetic pathways and regulatory mechanisms have now paved the way for more rational structural modifications through combinatorial biosynthesis and yield improvements using metabolic engineering.KEY WORDS Microbial secondary metabolites; Biosynthetic gene cluster; New drug discovery; Combinatorial biosynthesis; Metabolic engineering3微生物产生的次级代谢产物在化学结构和生物活性方面多种多样，主要的产生菌类群包括放线菌、芽孢杆菌、粘细菌、假单胞菌、蓝细菌、真菌等，其中已知抗生素的三分之二以上是以链霉菌为代表的放线菌产生的。
根据结构特点可以基本上将抗生素分为 β内酰胺、氨基糖苷、核苷、四环素、多肽、糖肽、大环内酯、安莎、聚醚和类萜等种类以上多种多样抗生素的结构特点也决定了它们生物活性的多样性，除了可以抑菌杀菌外，还可以作为抗癌药、抗寄生虫药、除草剂、酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂、低血胆固醇治疗剂等等，在医疗、工业、农牧渔业和环境保护等领域均发挥着重要作用随着大量微生物次级代谢产物的分离，从自然界直接分离具有新结构、新活性化合物变得越来越困难，已知结构化合物分离的重复性很高另一方面，临床上病原微生物的耐药性日益严重，伴随着多耐药性、高耐药性病原菌以及艾滋病、SARS、禽流感等新型疾病不断出现，如何利用已有资源，定向创造新结构、新活性化合物以及提高微生物次级代谢产物的产量，成为当务之急分子生物学基础上的组合生物合成(combinatorial biosynthesis)［1］和代谢工程(metabolic engineering)［2］成为解决上述问题的重要手段，但是次级代谢产物生物合成基因(簇)的克隆与功能鉴定是这两项技术实施的必要前提1 微生物次级代谢产物生物合成基因簇特点及总体研究进展41.1 微生物次级代谢产物生物合成基因簇的组成特点自从Malpartida 等 1984 年克隆了放线紫红素的全部生物合成基因［3］ ，以及随后克隆的榴菌素［4］ 、红霉素［5 ， 6］ 、泰乐星等生物合成基因，揭示了微生物次级代谢产物生物合成基因成簇排列的特征，即与特定产物合成相关的结构基因、调节基因、耐药性基因和转运蛋白等集中位于染色体的一段连续区域。
除此之外，微生物次级代谢产物生物合成基因簇还具有以下几个特点：①生物合成基因一般形成几个不同的转录单位；②通常含有一个以上的耐药性基因，且耐药性基因和结构基因表达之间有一定的相互调节；③绝大多数基因表达的调控发生在转录水平，除了受特异的途径专一性调节因子调控外，还受到同时影响胞内其他产物合成甚至细胞分化的全局性调节因子的调控［7］ 微生物次级代谢产物生物合成基因的成簇排列特征为相应生物合成基因的克隆提供了方便，也就是说，几乎任何一个结构基因、耐药性基因、转运蛋白基因或途径专一性调节基因的克隆都有可能导致整个生物合成基因簇的获得1.2 微生物次级代谢产物生物合成基因簇的克隆情况根据微生物次级代谢产物生物合成基因簇的上述特点，大量的生物合成基因簇从不同的微生物种群中克隆出来，其中主要的克隆方法有突变株回补(如放线紫红素［3］)、利用同源性较高的异源 DNA 作为探针的杂交法(如榴菌素［4］)、耐药性基因的克隆(如红霉素［5］)、5从蛋白质分离到反推编码 DNA 的反向遗传(如利福霉素［8 ］)、根据同源蛋白保守区设计的兼并性引物扩增法(如阿卡波糖［9］) 以及整个生物合成基因簇的异源表达(如肠球菌素［10］)等。
通过上述克隆方法，迄今为止已经克隆了超过 150 种微生物次级代谢产物的生物合成基因簇，一方面进一步证明了微生物次级代谢产物成簇排列的特点，另一方面也揭示了结构上不同的代谢产物在编码基因上的相关性，例如 β 内酰胺类、多肽类、糖肽类都主要由非核糖体肽合酶(nonribosomal peptide synthase，NRPS)［11］负责合成，四环素类、大环内酯类、安莎类、聚醚类则由 I 型或 II 型聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)［1］合成因此根据编码基因种类的不同，所有已克隆的生物合成基因簇可以按表 1 中所列的类别来归类1.3 次级代谢产物生物合成基因簇资源的定向利用如此众多生物合成基因簇的克隆为微生物次级代谢产物的比较研究打下了坚实的基础1985 年 Hopwood 等将放线紫红素的生物合成基因转入榴菌素和麦德霉素产生菌获得杂合抗生素［12］ ，标志着微生物次级代谢产物组合生物合成技术的诞生，即通过将不同次级代谢产物合成基因在微生物间的相互交换产生非天然的基因组合，从而人为定向设计具有新结构的次级代谢产物的遗传操作过程迄今为止，组合生物合成的理论基础和技术储备已经相当丰富，并且产生了数百种非天然的“天然产物”(nonnatural natural product)。
20016年 Thorson 教授首先提出了将化学合成和酶催化进行有机结合的体外糖类随机化(in vitro glycorandomization，IVG) ［13］的新概念，即把通过化学方法高效合成的多种自由糖基，在定向进化产生的具有底物识别广谱性糖基激酶、核苷转移酶和糖基转移酶的级联催化下，在体外转移到多种糖基受体，从而大量产生多种新结构、新活性衍生物的过程他们利用万古霉素的糖基转移酶 GtfE 和许多非天然的 NDP 糖基供体一次性获得了 32 种携带有不同糖基的万古霉素衍生物，充分显示了该项技术的高效性和巨大潜力微生物次级代谢产物完整生物合成基因簇的克隆和功能分析使得生物合成途径及生物合成调控机理的阐明成为可能，从而揭示生物合成途径的限速步骤和调控节点，并进行相应的遗传操作来显著提高次级代谢产物的产量或提高活性组分的比例、降低消除低活性组分的含量因此在基因簇克隆和遗传分析基础上的代谢工程研究也变得目的性更强、效率更高例如，Malmberg 等在利用棒状链霉菌研究头霉素 C 的生物合成过程中发现，控制从初级代谢产物赖氨酸向头霉素前体 α 氨基己二酸转化的赖氨酸 ε 氨基转移酶(LAT)是头霉素 C 生物合成的限速酶，额外拷贝 LAT 向棒状链霉菌的引入致使头孢霉素C 的产量提高了 2～5 倍［14］ 。
2 上海交通大学分子微生物学实验室的研究进展我们实验室长期从事重要的农业、饲养业抗生素生物合成的7研究，包括抗水稻纹枯病的井冈霉素和 5102I 号素、抗稻瘟病的庆丰霉素、抗玉米小斑病的 5102II 号素和静丝霉素、 广谱抗真菌多抗霉素、 抗鸡球虫病的南昌霉素、广谱杀虫活性的梅岭霉素等近年来我们也在抗真菌抗生素 FR008/克念菌素、抗肿瘤和 HIV 口恶唑霉素、抗肿瘤安丝霉素的生物合成方面进行了深入研究 表 1 已克隆的微生物次级代谢产物生物合成基因簇（略） 2.1 井冈霉素/5102I 的生物合成氨基糖苷类井冈霉素是由吸水链霉菌井冈变种 5008 产生的重要农用抗生素，是我国乃至东南亚防治水稻纹枯病的重要药物，年产量已经超过 4 万吨井冈霉素和有效霉素(validamycin) 的结构一致，即结合有一分子葡萄糖基的井冈胺/有效氧胺(validoxylamine)井冈霉素的大面积使用使提高其产量(尤其是活性组分 A 组分的含量) ，降低生产成本具有重要的意义井冈霉素也是生产临床上重要的治疗糖尿病药物伏格列波糖(vogliobose)和阿卡波糖的重要前体，其产量的提高和特异合成中间体的积累将显著降低生产成本或简化生产工艺。
井冈霉素和阿卡波糖同属于 C7N 氨基环醇类次级代谢产物，前期的化学喂养实验证实由 7 磷酸景天庚酮糖环化而成的 2 表 5 表有效醇酮是两者生物合成途径中共同的前体物，因此推断催化该步反应的环化酶基因应该有较高同源性［15］ 利用来自于游动放线菌 SE50/110 阿卡波糖生物合成基因簇的环化酶基因 acbC 为异源探针，我们在井冈变种85008 的基因文库中钓取了覆盖约 70kb 染色体区域的阳性克隆，随后该区域内 30kb 大片段的缺失导致突变株丧失了合成井冈霉素的能力，直接证明了该区域同井冈霉素的生物合成直接相关［16］ 对 acbC 同源环化酶基因 valA 两侧 45kb 区域的序列测定揭示了27 个开放阅读框(open reading frame,ORF)(白林泉等，待发表) ，其中包括 16 个结构基因，2 个调节基因，1 个转运蛋白基因，3 个与转座有关的基因，1 个抗碲基因和。