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1、蚌埠学院本科毕业设计（论文）- 3 -一株纤维素酶产生菌的鉴定及酶学性质一株纤维素酶产生菌的鉴定及酶学性质 研究研究1 1 引引 言言1.1 研究纤维素酶的作用和意义 纤维素是植物纤维的主要成分，也是地球上最丰富的可再生有机资源。据报道，全世界每年通过光合作用产生的纤维素，其中有 89%尚未被人类利用，我国每年仅农业生产中形成的农作物残渣(稻草、秸秆等)就约有 7 亿 t，如何有效利用这些资源已经成为近年来研究的热点。纤维素占植物干重的 35%-50%，是地球上分布最广的碳水化合物，同时又是自然界数量最大的可再生资源。纤维素废弃物的有效利用和生物转化已成为世界上许多国家关注的重要科研领域之一。
2、要使纤维素酶真正能够用于工业生产，首先要降低纤维素酶的生产成本。因此，选育高酶活的纤维素分解菌株就成了解决问题的关键之一。1.2 牛牛胃胃消消化化纤纤维维素素图 1-1 图 1-2瘤胃微生物 (rumen rnicrobes)是指栖息在瘤胃中的微生物 。瘤胃是反刍动物降解纤维素的消化器官，纤维素的降解靠瘤胃微生物分泌的纤维素分解小宇：一株纤维素酶产生菌的鉴定及酶学性质研究- 4 -酶，瘤胃内含有复杂的微生物区系，不同的微生物对纤维素和其它营养物质的消化各显功能，并有互补作用。纤维素的消化是纤维素酶水解的结果，纤维素酶是多组分复合酶，主要为内切型葡聚糖酶 ，外切型葡聚糖酶和 -葡萄糖苷酶。瘤胃微
3、生物通过合成和分泌-1，4-纤维素分解酶复合物，确保了对植物细胞壁的水解，调控瘤胃内环境促进微生物分泌消化酶，或者向饲料中添加酶制剂，都有利于饲料纤维素的利用 。瘤胃微生物能分泌纤维素酶，因此瘤胃有较强的发酵和分解纤维素的作用。在瘤胃微生物中，对纤维素降解起主要作用的还是瘤胃细菌。本文主要从牛胃液中分离出兼性氧的高产纤维素酶细菌，对分离所得菌株进行初步鉴定及并对其发酵产纤维素酶 的酶学性质 进行初步探讨， 从而为最终得到产纤维素酶 ，性能优良的微生物菌株 。2 菌种的鉴定2.1 材料与方法2.1.1 实验的菌种 实验用的菌种由齐肇然 同学提供的产纤维素酶枯草 芽孢杆菌属的 Q 菌种。2.1.2
4、 培养基固体培养基：蛋白胨 5.0g，(NH4)2 2S04 1.0g，羧甲基纤维素钠 CMCNa 10.0g，NaCl3.0g，KH2PO4 2.0g，MgSO47H2O 1.0g，FeSO47H20 10.0mg、MnSO4H20 5.0mg，琼脂粉 20.0g，蒸馏水 1000mL，调 pH 值6.7。发酵培养基：蛋白胨 2.0g，酵母膏 1.0g，(NH4)2SO4 2.0g，CMC-Na 20.0g，NaC1 3.0g，KH2PO4 2.0 g，MgSO47H20 1.0g，FeSO47H2O 10.0 mg MnSO4H2O 5.0mg，调 pH 值 6.7。Q 菌的硫化氢培养基：
5、蛋白胨 10.0g ，牛肉膏 10.0g ，酵母膏 5.0g ，柠檬酸氢二铵（NH4）2HC6H5O7 2.0g，葡萄糖(C6H12O6H2O) 20.0g，乙酸钠（CH3COONa3H2O）5.0g ，磷酸氢二钾（K2HPO43H2O）2.0g，硫酸镁（MgSO47H2O）0.58g ，硫酸锰（MnSO4H2O）0.25g，琼脂 18.0g、蒸馏水1000mL，pH6.26.6。蚌埠学院本科毕业设计（论文）- 5 -Q 菌的硝酸盐培养基：硝酸盐培养基 ，硝酸盐培养基成分为硝酸钾0.2g 蛋白 5g，蒸馏水 1000mL，pH 7.4。试剂：甲液（对氨基苯磺酸 0.8g 5moL/L 醋酸 l
6、OOml；乙液（-奈胺 0.5g+5moL/L 醋酸 lOOmL）。Q 菌的酚红肉汤基础培养基： 肉汤培养基的碳源为甘油，称之为甘油肉汤培养基，胨 20g，甘油 10mL，氯化镁(无水) 1.4g，琼脂 14g，硫酸钾(无水) 10g， 水 1000mL 取胨，氯化镁和硫酸钾加入水中，微温溶解，调节 pH 使灭菌后为 7.30.1，加入甘油和琼脂，加热溶化，混匀，分装于试管，灭菌，制成斜面。2.1.3 实验的主要试剂及 仪器试剂：香柏油，二甲苯， 3%过氧化氢溶液 ，锌粉，葡萄糖，果糖，山梨醇，甘露糖，半乳糖，乳糖，麦芽糖。硝基水杨酸试剂(DNS)，1%CMC-NA溶液，蛋白胨，牛肉膏，尿素，
7、硫酸铵，硝酸钠，0.05 mol/L 柠檬酸缓冲液等。仪器：显微镜，染色片，酒精灯，接种针 ，DHP-9272 型电热恒温培养箱；UV-2000 分光光度计；pHS-25 型 pH 计；电热恒温水浴锅；高速离心机；恒温摇床等。2.2 形态学观察2.2.1 实验的内容用显微镜观察 Q 菌染色装片。2.2.2 实验材料和用具 Q 菌的染色装片，香柏油，二甲苯，显微镜，擦镜纸。2.2.3 操作步骤将显微镜的置于平稳的实验台上，调节好光源；上升镜筒，将Q 菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片 0.5cm 处，适当缩小光圈，然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜
8、逐渐上升至发现物象时，改用细调 节器调节到物象清楚为止。移动装片，把合适的观察部分移至视野中心；眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与破片相撞。再用目镜观察，仔细小宇：一株纤维素酶产生菌的鉴定及酶学性质研究- 6 -调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部分移至视野中心。不要移动装片位置，准备用油镜观察；提起镜筒约 2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位滴香柏油。从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调
9、 节器将镜筒徐徐上升，直至视野中有物象出现时，再用细调节器校正焦距。如因镜头下降至未到位或镜头上升太快未找到物象，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。2.2.4 实验观察的结果Q菌落：呈直径3-7mm圆形，中央略凹陷；菌落呈白色，有光泽，菌落突起，边缘平整；部分有芽孢，芽孢呈椭圆。2.3 生生理理生生化化鉴鉴定定2.3.1 Q 菌的革兰氏染色革兰氏染色法 ：将 Q 菌株初染，酶染、脱色，复染等四个步骤，具体操作方法是： 将 Q 菌的涂片固定；草酸铵结晶紫染 1 分钟；自来水冲洗；加碘液覆盖涂面染 3 分钟；水洗，用吸水纸吸去水分 ；加 95%酒精数滴，并轻轻摇动进 行脱色，
10、20 秒后水洗，吸去水分。蕃红梁色液（稀）染 10 秒钟后，自来水冲洗 ；干燥，镜检。 染色的结果 :Q 菌体呈紫色。说明 Q 菌是革兰氏阳性菌。2.3.2 Q 菌的硫化氢试验 及其运动性的判断(1)菌种：Q 菌的硫化氢培养基 ,内含蛋白质与硫代硫酸钠作为硫受质 的培养基，另含硫酸铵亚铁作为硫化氢指示剂 。(2)器材：酒精灯，接种针 (3)实验步骤 无菌操作将 Q 菌分别穿刺接种至培养基中。将所有试管置于 35下培养 24-48 小时。 (4)结果分析：检视培养基，观察接种线有 黑色产生。依观察所见，判断 Q 菌是具有产生硫化氢之能力。 蚌埠学院本科毕业设计（论文）- 7 -观察 Q 菌，没有
11、沿接种线向四周扩散，并判断其不 具有运动性。2.3.3 Q 菌的触酶试验(1)原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。 (2)试剂：3%过氧化氢溶液。 (3)方法：直接滴加 3%过氧化氢的 H 细菌培养物中，立即观察结果。 (4)结果：不产生气泡 ，证明 Q 菌为阴性。 23.4 Q 菌明胶水解试验(1)方法：挑取 1824h Q 菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3 深度或点种于平板培养基。于 3436培养 714 天。明胶高层亦可培养于 361。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动，静置冰箱中待其凝固 后，再观察其是否
12、被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂，若为阳性， 1020min 后，菌落周围应出现清晰带环。否则为阴性。(2)结果：Q 菌未被液化，在菌落上滴加 明胶试剂，1020min 后，菌落周围没出现清晰带环。证明 Q 菌的水胶试验 为阴性。2.3.5 Q 菌硝酸盐还原试验(1)原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。但硝酸盐还原
13、的过程因细菌不同而异，有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌；有的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如假单胞菌等。硝酸盐还原试验系测定还原过程中所产生的亚硝酸。(2)Q 菌的硝酸盐培养基(3)步骤：将 Q 菌接种于硝酸盐培养基中，于 35培养 2d。将甲液和乙液等量混合后（约 0.1mL）加入培养基内，立即观察现象 。(4)试验现象：无颜色变化；加入少许锌粉后，出现红色。(5)试验结果分析：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应，可能小宇：一株纤维素酶产生菌的鉴定及酶学性质研究- 8 -是：硝酸盐没有被还原，试验阴性 ；硝酸盐被还原为氨和氮等
14、其他产物而导致假阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表示试验为假阴性。表 2-1 H 细菌的生化反应结果项目H 菌硫化氢试验阳性触酶试验阴性明胶水解试验阴性硝酸盐还原试验阴性运动性阴性2.3.6 Q 细菌的糖或醇发酵实验的结果(1)原理：不同种类细菌含有发酵不同糖 ,醇类的酶，因而对各种糖，醇的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖，醇，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌对培养基中所含糖，醇 降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。 糖，醇发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖，醇 ，如沙门菌可发酵葡萄糖，
15、但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸 ，产气，故可利用此试验鉴别细菌。(2)方法：在酚红肉汤基础培养基 pH 7.4 加入 0.51.0%（w/v）的特定糖，醇或苷类。所使用的糖，醇或苷 类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等 。将待鉴定的 Q 细菌接种入试验培养基中，置 35恒温箱内 30h 后，观察结果。(3)结果：能分解糖，醇或苷 产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色） ，产气的细菌可在小倒管中产生气泡，固体培养基则
16、产生裂隙。不分解糖则无变化。表 2-2 H 菌的糖或醇发酵实验的结果项目H 菌葡萄糖阴性蚌埠学院本科毕业设计（论文）- 9 -果糖阴性山梨醇阴性甘露糖阴性半乳糖阴性乳糖阴性麦芽糖阴性3 H 菌酶学性质的研究3.1 最适生长条件3.1.1 最适的生长温度将菌株直接从斜面转接到筛选平板上，采用四点种植法，分别于20，25，30，35，40，43，48下培养 48h。观察到 Q 菌能在 20至 48生长，从表中是实验结果可以看出，该菌的最适温度是35左右。表 3-1 不同温度下细菌的水解圈大小3.1.2 最适生长 pH 值 将菌株直接从斜面接到 pH 值分别为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，l2.0 的筛选平板上，在 37下恒温培养 2d。实验结果如表 3-2 所列。实验结果表明，该菌在pH 3.0 和 pH 120 下不生长；在 pH 4.0，5.0，l1.
