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1、研究生个人简介苗怡然，男，2 6 岁，江苏徐州人。1 9 9 3 年至1 9 9 9 年就读于徐州市坝子街小学；19 9 9 年至2 0 0 2 年就读于徐州市第十中学；2 0 0 2 年至2 0 0 5 年就读于徐州市第一中学；2 0 0 5 年至2 0 1 0 年就读于徐州医学院临床医学系；2 0 1 0 年至2 0 1 3 年就读于徐州医学院研究生学院肿瘤学专业。大学本科期间通过了国家英语六级考试、国家计算机二级考试，多次获得各类奖学金。曾担任年级学生会主席，大四期间在淮安市第二人民医院见习，大五期间在徐州市第一入民医院实习。应届考取徐州医学院肿瘤学研究生，导师为徐州医学院附属医院肿瘤内
2、科朱正秋教授。研究生期间主要参与导师的课题研究，包括江苏省卫生厅课题、江苏省“六大人才高峰”资助项目。在徐州医学院附属医院肿瘤内科进行了1 年的临床培训，并已取得国家临床执业医师资格证书。目录缩略词表1中文摘要2A b s t r a c t 4前言一6材料和方法一81材料一82 方法1 l结果1 9讨论j 2 3结论2 7参考文献3 8综述4 0攻读硕士学位期间发表学术论文题目4 7临床培训小结4 8致谢5 0论文独创性声明5 1论文使用授权声明5 1论文审阅认定书5 2徐州医学院硕士学位论文缩略词C e rD A BD M S OF B SI O D妞P B S印mS l PS K I -
3、 I IS P FS p hS p h KS p h K lV E G F英文全称C e r a m i d e缩略词表A b b r e v i a t i o nD i a m i n o b e n z i d i n eD i m e t h y ls u l p h o x i d eF e t a lc a l fs e r u mI n t e g r a t e do p t i c a ld e n s i t yK i l o D a l t o n sP h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n er o l l sp e rm i
4、n u t eS p h i n g o s i n e - 1 - p h o s p h a t eS p h i n g o s i n ek i n a s ei n h i b i t o r S p e c i f i cp a t h o g e nf r e eS p h i n g o s i n eS p h i n g o s i n ek i n a s eS p h i n g o s i n ek i n a s e 一1中文全称神经酰胺3 ，3 一二氨基联苯胺二甲基亚砜胎牛血清积分光密度千道尔顿磷酸盐缓冲液每分钟转数1 磷酸鞘氨醇鞘氨醇激酶抑制剂无特异病原体神经鞘
5、氨醇鞘氨醇激酶鞘氨醇激酶1V a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r 血管内皮细胞生长因子徐州医学院硕士学位论文S p h K l 在人胃癌裸鼠移植瘤生长中的作用研究中文摘要目的研究鞘氨醇激酶- 1 ( S p h i n g o s i n el 【i n 勰e 1 ，S p h m ) 在人胃癌裸鼠移植瘤生长中的作用，并探讨其机制。方法将培养至对数生长期的S G C 7 9 0 1 ( 人胃癌) 细胞注射于裸鼠皮下，建立人胃癌裸鼠移植瘤模型，建模成功后将裸鼠随机分为4 组，每组8 只，分别用生理盐水、鞘氨醇激酶抑制剂
6、一I I ( S p h i n g o s i n ek i n 舔ei n h i b i t o rI I ，S K I ) 、顺铂、S K I I I 联合顺铂进行治疗，每周注射1 次，共3 次。定期测量肿瘤体积，绘制肿瘤时间一体积生长抑制曲线，在治疗结束后的第7 天脱颈处死全部裸鼠，取下瘤体组织，免疫组化法及W e s t e r nb l o t 法检测瘤体内S p h K l 、B a x 、B c l 2 蛋白的表达情况，T U N E L 法检测肿瘤组织细胞凋亡。结果1 成功构建了人胃癌裸鼠移植瘤模型。2 肿瘤时间一体积生长抑制曲线结果显示移植瘤生长速度由快到慢依次为：对照组
7、 S K I I I 组 顺铂组 联合用药组。3 免疫组化及W e s t e r nb l o t 结果显示：S K I - I I 单独及联合顺铂应用于荷瘤裸鼠后，均能通过抑制S p h K l 蛋白的表达增加B a x B c l 2 的比值，且联合用药组能较S K I - I I 组和顺铂组更显著地减少肿瘤组织S p h K l 、B c l 一2 蛋白的表达( 尸，o 0 5 ) ，并增加B a x 蛋白的表达泳0 0 5 ) 。4 T U N E L 结果显示：S K I I I 组、顺铂组、联合用药组的凋亡率均大于对照组，差异有统计学意义( 氏0 0 5 ) ，联合用药组的凋亡率
8、大于S K I I I 组及顺铂组，差异有统计学意义( 氏O 0 5 ) 。5 实验结束后，S K I - I I 组裸鼠的体质量高于对照组，差异有统计学意义( 氏0 0 5 ) ：顺铂组的体质量低于对照组，差异有统计学意义( P S K I - I Ig r o u p c i s p l a t i ng r o u p c o m b i n e dg r o u p 3 I m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n dW e s t e r nb l o tr e s u l t ss h o w e dt h a t ：S K I I Ia l
9、 o n eo ri nc o m b i n a t i o nw i t hc i s p l a t i ni nn u d em i c e ，i n c r e a s e dt h er a t i oo fB a x B c l 一2i n h i b i tt h ee x p r e s s i o no fS p h K lp r o t e i n ，a n dt h ec o m b i n a t i o ng r o u pt h a nS K I - I Ig r o u po rc i s p l a t i ng r o u pW a sm o r es i
10、g n i f i c a n t l yr e d u c et h ee x p r e s s i o no fS p h K l ，B c l 一2p r o t e i ni nt u m o rt i s s u e S t a i n ) ，仔细观察管口状况，防止水气进入管内，按序上样。接通电源，调节电压至1 0 0 V ，开始电泳。约3 0 r a i n 后溴酚蓝到达分离胶与浓缩胶的分界面，暂停电泳，调节电压至2 0 0 V ，继续电泳。待溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源，电泳结束。2 4 3 转膜从电泳槽里取出玻璃板，裁制凝胶，将凝胶正面向下放入半干转液中浸润1 0 r a
11、i n 。由上到下按照如下顺序装板：负极板一滤纸一凝胶卟T C 膜一滤纸一正极板。接通电源，调节电流至0 3 5 A ，转膜4 5 r a i n 。2 4 4 封闭及加一抗取出一只新的培养皿，倒入封闭液，用镊子将N C 膜转移到封闭液中，放在摇徐州医学院硕士学位论文床上，封闭3 h 后，将N C 膜放入装有一抗( S p h K l 浓度l ：5 0 0 ，B a x 浓度1 ：5 0 0 ，B c l 2浓度1 ：5 0 0 ) 的培养皿中，放在摇床上，4 “ C 过夜。2 4 5 加二抗停止摇动，复温3 0 m i n ，回收一抗。1 W a s h i n gb u f f e r 洗
12、膜3 次，每次5 m i n 。用镊子将N C 膜转移至二抗培养皿里( 1 ：5 0 0 ) ，放在摇床上，室温摇动2 h 。2 8 6 显色移液器吸去二抗，将N C 膜放入W a s h i n gb u f f e r ，在水平摇床上洗膜3 次，每次5 m i n ，用镊子取出N C 膜，放在滤纸上吸干，转移至N B T B C I P 底物显色液( 现用现配) 里避光情况下仔细观察显色情况，待蛋白条带达到要求后，倒掉显色液，加入d ( m 2 0 终止显色，取出条带晾干，晾干后N C 膜以扫描仪扫描( 像数8 0 0 ，- -1 0 0 0 d p i ) ，并用I m a g eP r
13、 oP l u s6 0 图像分析软件分析图片上每个条带灰度值的变化。2 5T U N E L 法检测瘤体组织凋亡2 5 1 移植瘤用4 的中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片。2 5 2 二甲苯脱蜡3 次，每次5 m i n ；9 5 酒精浸泡2 次，每次5 m i n ，双蒸水冲洗2 次，每次3 m i n 。2 5 3 加3 H 2 0 2 ，置于室温1 0 m i n ，以阻断内源性过氧化物酶。2 5 4 加2 0 9 9 m l 的蛋白酶K 消化2 0 m i n 。2 5 5P B S 冲洗3 次，每次3 m i n ，滴加T U N E L 反应混合液( A 液：B 液按1 ：9
14、混合) ，切片放在湿盒内置3 7 温箱中孵育l h 。2 5 6P B S 冲洗3 次，每次3 m i n ，滴加1 0 a l l 羊血清，置3 7 “ C 温箱中温育2 0 m i n ，防止P O D 转换剂的非特异性结合。2 5 7 甩干后滴加P O D 转换剂，置3 7 。C 温箱中温育3 0 r a i n 。2 5 8P B S 冲洗3 次，每次3 m i n ，D A B 显色5 - - , 1 0 分钟，P B S 冲洗3 次。2 5 9 苏木素液复染2 r a i n ，自来水冲洗。2 5 1 0 盐酸酒精分化数秒，N a H C 0 3 中蓝化l m i n ，大量自来水冲洗5 m i n 。徐州医学院硕士学住论文2 5 1 1 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，电镜下观察并拍照。2 5 1 2 选取4 0 0 倍镜下3 2 个移植瘤切片的扫描图像各l 张，计算凋亡细胞数及凋亡率( 凋亡细胞数总细胞数1 0 0 ) 。3 统计学分析采用S P S S1 6 0 软件包进行统计学处理，计量资料用均数标准差( i s ) 表示，不同时间点的
