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1、1广藿香愈伤组织诱导和分化再生植株的研究作者：林小桦，贺红，吴立蓉，张燕玲，刘星【摘要 】 【目的】开展广藿香愈伤组织的诱导及分化再生植株的研究，建立高效的组织培养再生系统。 【方法】以广藿香叶片、带节茎、不带节茎及根尖为材料进行离体培养，筛选影响愈伤组织诱导、增殖及分化的因素。 【结果】6 苄氨基嘌呤(BA) 或 N苯基N123噻二唑5 脲(TDZ)与 萘乙酸(NAA)配合有利于愈伤组织的诱导，BA 的适宜浓度为 02 05mg/L；4 种外植体中，带节茎及不带节茎较易诱导出愈伤组织。BA 和 NAA 配合使用能较好地促进愈伤组织的增殖；培养 30d 的愈伤组织较 60d 的具有更强的增殖和
2、分化能力。BA 有利于愈伤组织的分化；叶片诱导的愈伤组织分化能力较强。 【结论】建立了高效的广藿香愈伤组织诱导及分化再生植株的离体再生体系。 【关键词】 广藿香/生长和发育；离体培养；愈伤组织Abstract: ObjectiveCallus induction and plantlets regeneration of Pogostemon cablin(Blanco)Benth. are studied to establish a highefficiency regeneration system for tissue culture.MethodsThe leaf segments,
3、 nodular stem segments, 2stem segments and root tips from Pogostemon cablin(Blanco)Benth. were cultured in vitro. The factors which affect the induction，multiplication and differentiation of callus were studied. ResultsBenzylaminopurine (BA) or thidiazuron (TDZ) combined with naphthylacetic acid (NA
4、A) was helpful to induce callus. The optimal concentrations of BA were 0205mg/L. Nodular stem segments and stem segments were the most suitable explants for callus induction. The medium containing BA and NAA promoted the multiplication of callus. The multiplication rate and differentiation rate of 3
5、0day callus were much higher than those of 60day callus. BA was helpful to induce callus differentiation. The callus from leaf segments exerted a higher differentiation rate. ConclusionA highefficiency regeneration system of callus induction and plant regeneration from Pogostemon cablin(Blanco)Benth
6、.has been established.Key words:POGOSTEMON CABLIN(BLANCO) BENTH./growth & development;INVITRO CULTURE;CALLUS3广藿香Pogostemon cablin (Blanco) Benth.为唇形科刺蕊草属植物，以干燥地上部分入药，其性辛、微温。具有芳香化湿，开胃止呕，发表解暑的功效1 。广藿香为广东道地药材， “十大广药”之一，是多种著名中成药“藿香正气丸” 、 “藿胆丸”等以及现代中药制剂“抗病毒口服液”的主要原料。广藿香原产于菲律宾、马来西亚等国，最早自宋代引入我国，栽培历史悠久。广藿香生
7、产中面临青枯病的危害，该病由青枯菌（Ralstonia Solanacearum）侵染所致，为典型的维管束病害23 。在我国产区栽培的广藿香，罕见开花结实4 ，长期以来，生产上采用扦插繁殖，病原体通过无性繁殖传递，且逐代积累，危害越来越严重，迫切需要进行抗病品种的选育。近年来，基因转移及人工诱变等改良药用植物农艺性状的技术，为广藿香抗病育种提供了可能，而要开展相关的研究，首先要建立高效的组织培养再生系统。本文以广藿香多种外植体为材料，筛选影响广藿香愈伤组织诱导、增殖及分化的多种因素，以期建立高效的愈伤组织诱导及分化再生植株的离体再生系统，为遗传转化及人工诱变育种奠定基础，现报道如下。1 材料和
8、方法11 材料试验材料采自广州中医药大学药圃，选择生长健壮、无病虫害的4广藿香单株，取其顶芽、带节茎及叶片；经蒸馏水冲洗干净后，用体积分数为 70%乙醇浸泡 30s，转入 1g/L 的 HgCl2 溶液浸泡消毒10min，再用无菌水漂洗 58 次，把残留 HgCl2 漂洗干净，接种于 Murashge and Tucker（MT）+02mg/L 6苄氨基嘌呤(BA)培养基上，诱导丛芽的生成，待丛芽长出后将其移至 MT 培养基中培养，试管苗长至 5 7cm 时即可作材料使用。12 方法121 外植体培养取广藿香试管苗的叶片、带节茎、不带节茎及根尖为外植体进行培养。外植体在培养基中的放置方式为：叶
9、片及根尖平放，带节茎及不带节茎为形态学下端下插。每种处理接种外植体数为 30块左右，设置 3 次重复。122 愈伤组织的诱导增殖以广藿香叶片及带节茎等诱导愈伤组织，选取未分化出芽的愈伤组织接种至增殖培养基中。每种处理一般接种 30 块愈伤组织，设置 3 次重复。诱导及增殖培养基即以 MT 培养基为基础，根据试验要求添加不同浓度的 6苄氨基嘌呤(BA) 、 萘乙酸(NAA)、5N苯基 N123 噻二唑5 脲(TDZ)及二氯苯氧乙酸(24D)等植物激素组成。123 愈伤组织的分化以实验中诱导的愈伤组织为材料，接种至分化培养基中培养。每种处理一般接种 30 块愈伤组织，设置 3 次重复。分化培养基以
10、MT 为基础培养基，根据试验要求添加不同浓度的 BA、6 糠氨基嘌呤(KT)、NAA、3 吲哚乙酸(IAA)、TDZ 及 24D 等植物激素。124 无根苗的诱导生根及移栽将愈伤组织分化获得的再生苗接种至生根培养基MT+ 02mg/LIBA 中，进行诱导生根，生根后进行炼苗和移栽。13 培养条件培养室温度保持（261 ），每天光照 12h，光照强度为 2 500 3 000Lx。2 结果与分析621 愈伤组织的诱导以广藿香试管苗的叶片及带节茎等为材料，成功诱导出愈伤组织（图 1-a，彩图见第 200 页） ，并考察了不同植物激素及不同BA 浓度对愈伤组织诱导的影响，同时，观察了不同外植体诱导愈
11、伤组织能力的差异，以找出适合广藿香愈伤组织诱导的培养基及外植体种类。211 不同植物激素对愈伤组织诱导的影响以广藿香的带节茎和不带节茎为材料，设置不同植物激素及不同激素组合进行试验。结果显示，不添加任何植物激素及单独使用细胞分裂素（BA、 TDZ）未能诱导出愈伤组织，单独使用生长素（NAA、24D ）诱导出的愈伤组织灰白色，呈水浸状，其生长势较差。细胞分裂素与生长素结合，能成功诱导出愈伤组织，愈伤组织呈乳白色或灰白色，半透明、疏松状，生长势较好。如 BA 和NAA 结合，培养 10d 后，100的外植体产生愈伤组织；BA 和24D 配合使用时，10d 后愈伤组织诱导率达 85%以上，15d 后
12、诱导率为 100；TDZ 和 NAA 或 24D 配合使用，10d 后愈伤组织诱导率为 80%以上，15d 后诱导率均为 100，含有 24D的培养基中愈伤组织的生长势较含有 NAA 处理者稍好，愈伤组织7颜色更深，为灰白色。带节茎和不带节茎培养，均能成功诱导出愈伤组织，在培养 10d 时，带节茎愈伤组织诱导率略高于不带节茎，其生长势亦较好。添加 24D 诱导的愈伤组织，在愈伤组织培养一段时间后，会出现褐化现象，且部分死亡。因此愈伤组织诱导时，采用 BA 或 TDZ 与 NAA 结合较好，结果见表 1。表 1 不同植物激素对愈伤组织诱导的影响（略）注： 无愈伤组织，+ 差，+ 一般，+ 较好，
13、+ 旺盛212 不同浓度 BA 对愈伤组织诱导的影响以广藿香带节茎为材料，设置不同浓度的BA(0、01 、02 、05mg/L) 与 05mg/LNAA 配合使用，诱导愈伤组织，统计接种 15d 后的愈伤组织诱导率和生长势，比较不同BA 浓度对愈伤组织诱导的影响。结果表明，不添加植物激素或单独使用细胞分裂素 BA 未能产生愈伤组织，适当浓度的 BA 和 NAA 配合，则能较好地诱导出愈伤组织，BA 的适宜浓度为：0205mg/L ，其中，浓度为 02mg/L 时，愈伤组织的生长势最好。213 不同外植体诱导愈伤组织能力的差异将广藿香试管苗的 4 种不同外植体：叶片、带节茎、不带节茎及根尖，接种
14、至 MT+ 02mg/LBA +05mg/LNAA 培养基中，8观察不同外植体诱导愈伤组织能力的差异。结果表明：一般接种15d 后 4 种外植体均能产生愈伤组织，愈伤组织诱导率均达100。但不同外植体诱导的愈伤组织生长势表现明显的差异。带节茎诱导的愈伤组织生长势旺盛，愈伤组织黄白色，疏松；不带节茎诱导的愈伤组织生长势较好，愈伤组织黄白色，疏松；叶片诱导的愈伤组织生长势一般，颜色为浅绿色，致密；根诱导的愈伤组织生长势较差，愈伤组织灰白色，硬脆。在愈伤组织的分化实验中还观察到，叶片诱导的愈伤组织在短时间内分化出大量的芽；带节茎和不带节茎诱导的愈伤组织分化出芽的时间较晚，培养一段时间后可获得量较多的
15、愈伤组织；根诱导的愈伤组织不分化出芽，培养时间超过 30d 后即出现褐化现象。22 愈伤组织的增殖广藿香外植体培养能成功诱导出愈伤组织，但由于原代培养获得的愈伤组织的量较少，为了能够在较短的时间内获得较多的愈伤组织，以便能分化出更多的再生植株，因而设置了愈伤组织增殖试验。221 不同植物激素对愈伤组织增殖的影响将带节茎接种于 MT+02mg/LBA +05mg/LNAA 培养基9中诱导愈伤组织，30d 后取愈伤组织为材料，接种至以下 4 种培养基中：MT+ 02mg/LBA、MT+ 002mg/LTDZ、MT+005mg/L 24D 及 MT+02mg/LBA +05mg/LNAA，观察愈伤组
16、织的增殖情况。表 2 结果表明，愈伤组织在只含有 BA 或 TDZ 的培养基中难以生长，愈伤组织呈浅绿色，质地致密；在含有 24D 的培养基能部分增殖，愈伤组织灰白色，质地疏松；在同时含有 BA 和 NAA 的培养基中生长良好，增殖较快，愈伤组织白色，质地疏松。可见，24D 、BA 和 NAA 的配合使用均能较好地促进愈伤组织增殖，但后期的分化试验结果表明，在含24D 培养基上增殖的愈伤组织难以分化，因此，BA 和 NAA 配合使用，较有利于广藿香愈伤组织的增殖。表 2 不同植物激素对愈伤组织增殖的影响（略）222 愈伤组织培养时间对增殖的影响将广藿香带节茎接种于 MT+02mg/LBA +05mg/LNAA培养基中诱导愈伤组织，分别
