《平白术多糖与氨基酸提取及含量测定研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《平白术多糖与氨基酸提取及含量测定研究（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1平白术多糖与氨基酸提取及含量测定研究作者：陈文，李丽立，张平，姜曼花，邱细敏 【摘要 】 目的为开发利用平白术的药用价值提供理论依据，分别提取分离平白术中有效成分多糖和氨基酸，并分别测定平白术多糖和氨基酸的含量。方法采用 L9（34）实验因素设计实验，苯酚-硫酸法测定白术多糖的含量。以茚三酮为衍生试剂，采用柱后衍生法测定平白术中氨基酸含量。 结果平白术多糖的含量为 15.3% 。平白术中至少含有 17 种氨基酸，总氨基酸含量为 73.73 mgg-1。结论 方法简单、有效、快速、准确、灵敏，适合于分析测定白术中多糖和氨基酸的含量。 【关键词】 平白术；多糖；氨基酸Abstract:Objec
2、tiveTo extract polysaccharide and amino acidand determine their contents in order to offer the basis for using Atractylodes macrocephala Koidz from Pingjiang. MethodsUsing L9（34）orthogonal test，Phenolsulfuric method was used to test polysaccharide content in Atractylodes macrocephala and to assay am
3、ino acid using 2method of Ninhydrin post-column derivation .ResultsThe analysis of Atractylodes macrocephala Koidz showed that the content of polysaccharide was 15.3% and there were at least 17 kinds of amino acids，the total content was 73.73 mgg-1.ConclusionThe established method is quite suitable
4、for identification and quantification of polysaccharide and amino acids in Atractylodes macrocephala Koidz.It is simple，effective ， rapid，accurate and sensitive.Key words:Atractylodes macrocephala Koidz ； Polysaccharide; Amino acid白术是传统中药， 中国药典收载的白术为菊科植物Atractylodes macrocephala Koidz 的干燥根茎，白术具有健脾益气
5、、燥湿利水、止汗安胎之效1 。 中国药典 2005 年版第一部记载含白术的处方有 91 个。近几年以来，中国对白术的需求量大增，居全国大宗常用中药材之首。由于其含有白术多糖、挥发油、氨基酸等多种有效成分而倍受药物研究工作者的关注，使白术的临床应用日趋广泛2 ，其研究也更为深入、更为多元化。然而，迄今为止，对白术中营养成分氨基酸研究甚少。为了开发利用白术的药用价值，本文对湖南平江产白术平白术进行研究，提取平白术多糖、氨基酸，采用正交实验选择多糖显色条件，用苯酚-硫酸法3测定多糖含量。以茚三酮作衍生试剂，采用柱后衍生法测定氨基酸含量。1 材料1.1 仪器UV2150 型分光广度计（日本岛津） ，日
6、立 L8800 全自动氨基酸自动分析仪1.2 试剂无水乙醇、硫酸锌、氢氧化钡、硫酸、苯酚、茚三酮、柠檬酸。三钠、醋酸钠（均为分析纯）,平江白术（由湖南药材公司提供） 、果糖标准品（市售） 、氨基酸标准品（中国科学院亚热带农业生态研究所提供） 。2 方法与结果2.1 显色条件的考察2.1.1 苯酚浓度对显色单因素的影响吸取标准溶液 1 ml 于10 ml 具塞试管中，精密加入 1 ml 不同浓度的苯酚和 5 ml 浓硫酸，混匀，放置 5 min。移入 25的水浴中保温 20 min。冷却。以蒸4馏水 1 ml 加相应的试剂作空白，测定吸收度。见图 1，表 1。表 1 苯酚浓度的考察（略）实验结果
7、表明, 苯酚浓度在 4%7% 范围内所得吸收值相近 ,苯酚浓度为 5%时所得吸收值较大 ,故选择苯酚浓度为 5%。2.1.2 苯酚-硫酸法正交实验设计3实验因素水平表设计：实验选择苯酚用量（5% 苯酚） 、浓硫酸用量、水浴温度和水浴中的放置时间 4 个因素作为考察对象，根据初步实验，每个因素确定 3个水平，采用 L9（34）正交表进行实验（见表 2） 。以吸收度为评价指标（表 3） 。对结果进行统计学处理，得方差分析见表 4。表 2 实验因素水平（略）表 3 L9（34）正交实验结果（略）表 4 方差分析（略）经方差分析可知，苯酚用量、浓硫酸用量、水浴温度及水浴放置时间对吸收度影响不显著，但综
8、合比较，本实验选择苯酚-硫酸法最佳显色条件为 A3B1C3D2 即苯酚 1.2 ml，浓硫酸 4 ml，水浴温度25，水浴放置时间 30 min。2.2 测定波长的选择精密称取一定量多糖样品置小烧杯中，加水溶解，定量转移至 100 ml 量瓶中，加水至刻度，混匀。吸取该样品 2 ml 于试管中，加 5%苯酚水溶液 1.2 ml 混匀，迅速加入 4 5ml 浓硫酸，振摇 10 min，在 25水浴保温放置 30 min，取出冷却，以苯酚-硫酸溶液为空白，于 400800 nm 范围扫描，选择最大吸收波长 488.4 nm 为测定波长。2.3 标准曲线精密称取 105 干燥至恒重的标准果糖 18.
9、70 mg，加水溶解至 250 ml，配成 74.8 g/ml 的标准储备液。取 10 ml 具塞试管，分别加上述标准液 0.0，0.10，0.20 ，0.30，0.40 ，0.50，0.60，0.70 ml，加水稀释至 1 ml，摇匀，每个试管各加5%苯酚水溶液 1.2 ml 混匀，再迅速加入 4 ml 浓硫酸，振摇 10 min，在 25水浴保温放置 30 min 。以水作空白在 488.4 nm 处测定各标准液的吸收度，得回归方程 A=0.098 3C+0.0.092 6（r=0.999 4） 。其在 120.6 g/ml 浓度范围内呈良好的线性关系。2.4 换算因素测定精密称取干燥的平
10、白术多糖 20 mg，用蒸馏水溶解后定容至 100 ml，作为多糖储备液。精确量取多糖储备液0.2 ml，加水至 1.0 ml，按测定标准曲线同样的方法测其吸光度值。按下式计算换算因素：f=W/CD，试中：W 为多糖质量（g） ，C为多糖液中果糖的浓度（g/ml） ，D 为多糖的稀释因素，测得f=1.24。2.5 平白术多糖、氨基酸的提取62.5.1 平白术多糖的提取4 精密称取白术粗粉 50 g 置于1 000 ml 的容量瓶中，加 6 倍量 70%的乙醇回流 2 h。过滤，取滤渣加 8 倍蒸馏水回流 2 h，趁热过滤。在滤渣中加 6 倍水回流 1 h，趁热过滤。再在滤渣中加 3 倍量水回流
11、 1 h，趁热过滤，合并 3次滤液，浓缩至 100 ml，加无水乙醇至乙醇浓度达 85%，再用 75%乙醇冲洗，离心，反复 6 次，去溶液取沉淀。加水溶解，用 5% ZnSO4 4 ml 和饱和 Ba（OH）2 溶液 16 ml 振摇，离心去蛋白，反复 10 次5 。将所得溶液置于冰箱中过夜，次日取出溶解，在 8 000 r/min 离心 15 min，反复 4 次。用氯仿 -正丁醇（41 ）与溶液按 51 的比例混合搅拌 15 min，离心，反复 3 次，得澄清液即白术多糖溶液。加水至 100 ml 冷藏备用。2.5.2 平白术氨基酸的提取称取平白术粉末 40 g（过 80 目）投入装有搅拌
12、器、温度计、回流冷凝器的三颈烧瓶中，加入 6 mol/L 的盐酸 100 ml，加热水解 24 h，反应温度保持在(1101)左右。滤渣用少量稀盐酸浸泡，过滤，重复两次，收集 3 次滤液得水解液，加热 7h 赶盐酸。在滤液中加入 0.5 g 活性碳且维持滤液在(8090) ，磁力搅拌脱色 30 min，重复 2 次，减压浓缩得到 50 ml 橙红色的溶液，作为储备液。于 4 的冰箱中保存。2.6 平白术多糖和氨基酸含量的测定72.6.1 样品多糖含量的测定平白术多糖提取液稀释至适当倍数后，精密吸取 1.0 ml，按照标准曲线的方法测定吸光度，计算平白术多糖的含量。按下式计算多糖含量：多糖含量=
13、CDfW100%，式中：W 为多糖质量（ g） ，C 为多糖液中果糖的浓度（g/ml ） ，D为多糖的稀释因素，f 为换算因素。测得多糖的含量为 15.3%。2.6.2 回收率实验在样品液中精密加入不同浓度的果糖标准液（n=5） ，按 2.3 项下操作，并适当稀释，以样品液为空白，测定吸收度，计算回收率。平均回收率为 98.5%，RSD=2.1%（n=5） 。结果如表 5。表 5 回收率实验结果（略）2.6.3 稳定性实验取样品在 8 h 内测定吸收度，1 次/h。样品在 4 h 内稳定，RSD=1.2% 。2.6.4 平白术氨基酸的测定条件6实验条件：L-8800 型全自动氨基酸分析仪，钠型
14、阳离子交换柱（4.6 mm60 mm） ，分析时间 35 min，流动相柠檬酸三钠缓冲液（pH 3.24.9） ，四元梯度洗脱 ， 缓冲液流速 0.4 ml/min，茚8三酮流速 0.35 ml/min，缓冲液泵压力 811.5 Pa，茚三酮泵压力0.91.2 kPa，柱温 50，氮气压力 20 kPa。柱的衍生条件：反应液 A：390 g 茚三酮/L 丙二醇甲醚，反应液 B：醋酸钠/醋酸：丙二醇甲醚（6040） ；供试品和对照品溶液进样量均为 20 l。2.6.5 平白术氨基酸含量的测定按上述色谱条件，使用日立L-8800 AAA 分析仪进行样品测定。分离得到的氨基酸谱图如图23 。样品中氨
15、基酸的含量结果见表 6。表 6 平白术中氨基酸含量测定结果（略）3 讨论3.1 本实验采用 75%乙醇提取除去平白术所含单糖、低聚糖等干扰性成分后，再用水提醇沉法制得白术多糖。在采用 Sevag 法去蛋白至少重复 67 次，才能基本上除去蛋白，且多糖损失率也较大。本实验采用硫酸锌与饱和氢氧化钡溶液脱蛋白后，再加冷冻-Sevag 法除蛋白，去蛋白比较彻底。在进行乙醇沉淀时，85%的乙醇浓度已能将多糖基本沉淀出来，增加乙醇浓度对多糖的得率影响并不显著。多糖采用真空干燥法，可避免加热干燥而出现多糖变黏稠或碳化而结块现象。93.2 氨基酸是构成生物体蛋白质分子的基本单位 ，与生物的生命活动密切相关，尤
16、其与人类健康有着紧密的关系。本分析结果表明，平白术氨基酸至少含有 17 种氨基酸，总含量为 73.73 mgg-1。必需氨基酸和半必需氨基酸在人体中具有重要的作用，缺一不可，否则可引起生理功能异常，导致疾病。总氨基酸中含有苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等7 种人体必需氨基酸，并含胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸等 4种半必需氨基酸。必需氨基酸和半必需氨基酸在总氨基酸中分别占12.7%，17.8%。在水解氨基酸时，温度应严格控制在（1101），水解 24 h，才能使蛋白质完全水解。3.3 本研究为白术中有效成分多糖及氨基酸的提取分析、质量评价提供了一个新的定量标准，为开发利用平江白术提供了理论依据。【参考文献】1国家药典委员会.中国药典，部S .北京：化学工业出版社，2000：77.2刘思贞，邵玉芹，祝希娴. 白术药理研究进展J.时珍国医国药，1
