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1、GFP 成像研究植物细胞区室化的方法与应用成像研究植物细胞区室化的方法与应用 摘要 水母 gfp(绿色荧光蛋白)基因的克隆,以及它在转基因植物细胞内亚细胞定位表达的改进,已 经给细胞内组织学和动力学分析带来新的观念. GFP 与已知或非已知的完整蛋白的融合体 显示出这些蛋白的定位,以及它们是否从一个区室转移到另一个中去. 研究者审慎地将 GFP 与其具有不同光谱性质的变异体定于不同的区室中,分析它们在发育过程中或是响应环境变 化时大小、形状、流动性及动态的变化. GFP 变异体间的荧光共振能量转移(FRET)能够辨 别蛋白与蛋白之间是否结合. GFP 还被用作传感蛋白,去检测钙离子、pH、电压
2、、金属离子 及酶活性的变化或区分.GFP 的光漂白、光激活,与荧光相关光谱学的结合能测量 GFP 在区 室内或区室间的扩散和运动的快慢. 这份评论涵盖了过去这些方法的应用,以及 GFP 成像在 理解植物细胞的功能结构上的潜力发展. 关键词 绿色荧光蛋白 显微(镜检)术 细胞器 定位 光漂白 质体小管 共聚焦显微术 介绍 绿色荧光蛋白基因在细胞内表达的技术诞生,使十年前不敢想象的很多实验变成了现实. 在 很多应用中,人们可以有了新的探究途径去了解细胞活动的组织结构. 这份评论将着重于 GFP 表达和成像方法,它们在理解植物细胞内的区室化上已经并将继续提供前沿动力,而那 些关于如何使用特别的荧光,
3、共聚焦激光扫描及多光子显微术去观察 GFP 衍生的荧光蛋白, 则不在此累赘了. 不过可以在后面一些引用文献中找到,我将简要地介绍一下现有 GFP 成像 新应用的研究,而阐明可行的实验. 目前而言,GFP 成像在动物和真菌细胞中的成功运用要多于植物细胞,部分是因为早期存在 于如何在植物中使用水母 GFP 的问题. 这个初始的动物基因含有在植物中会被错误识别为 内含子的序列,导致了很低的表达水平. 当出现修饰型的、热稳定的、高亮度荧光的 GFP 之 后,其产量与分布已经带动了许多植物系统的实验.通过对表达与哺乳动物及其它生物体的 GFP 进行重新编码,可以得到适用于维管植物的新基因. 但是密码子的
4、改变经常会破坏隐秘 剪接位点,因而只是有些,而并非全部带有改变了的光谱特性的新 GFP 变种可以不经进一步 修正就可以在植物中发挥功能. 许多不同的 GFP 变异体在一系列评论和文章中讨论过,就不 在这里重复了.无论怎样,在实验设计中,如何选择一个带有正确特性的植物表达 GFP 变异体, 很明显是一个关键的抉择. GFP 作为一个荧光探针,最主要的一个优点是不需要外源的共激活因子. GFP 可以在整个组 织中表达,并且在整个检测过程中都不受引入外界试剂的干扰. 由于许多对动物细胞所采纳 的染色和染料不能渗透入植物细胞,GFP 技术可能最终成为植物细胞生物学而非动物的重要 推动力. 研究蛋白在细
5、胞内的定位 为了理解植物细胞是如何有功能地组织起来,就有必要知道在发育过程中,和受到特定环境条 件的影响下,特定时间下,特定植物细胞内,酶和调节蛋白在何处定位.一个特定酶的定位对于 理解细胞内新陈代谢的区室化是个关键的信号. 区室阻止特定蛋白、离子和复合物的进入, 以杜绝不需要的反应,同时汇集酶反应过程中的参与物以易化细胞内的生理活动. 一系列已 知的例子验证了,在一个特定反应中酶与底物共处一个区室,而其产物又在另一个区室中被使 用. 这就提出了问题,产物与底物是如何从一个区室运输到另一个来完成一个代谢途径. 植 物细胞也包含有许多亚细胞定位还未知的酶,进一步地说,通过基因组“蛮干“的测序,而
6、得到 的参与酶反应的未知酶,如果不能知道它的细胞内区室定位,则可能不能被很好地理解. 通过目前计算机的方法从 DNA 序列中预测细胞内定位,虽然又用,但不是结论性的.另外,一 些植物蛋白也已经被发现定位于超过一处的地方. 细胞器的分离及蛋白的纯化,在阐明细胞内定位上常存在技术上的难关.而在组织切片中去免疫检测一个蛋白,其抗体的制备又费时费 力.因而,将 GFP 的编码序列融合到未知定位基因地编码序列,对于决定在植物细胞内一个蛋 白,同时也是一个生化的、调节过程的位置,已经成为一种及其有用的方法. GFP 编码序列可以融合道目的基因的编码序列的 5端或 3端,翻译形成 N 端或 C 端的融合 G
7、FP. 这种融合基因已经被掺入到稳定遗传转基因植物,或是导入植物细胞用于瞬间表达.稳 定遗传的转基因植物的获得,可以检测多种不同的表达 GFP 融合蛋白的细胞种类.这种优势 的体现,在于技术上并非所有的细胞种类都适用于瞬间表达. 另外,由于 DNA 掺入常常引起 损伤,基因引入数量以及 GFP 在瞬间表达中转录都有不确定性,因此,有时候分析健康的稳定 转化体比起由于 DNA 掺入而受到影响的细胞来说,要更有说服力. 当然,瞬间表达由于快速 简单,是一种非常有用的工具,尤其是在投入时间去获得转化体之前. 洋葱表皮,有着极其例外 的清晰细胞质,及单层活细胞,是瞬间实验中非常有用的材料. 通过各种构
8、建体的粒子轰击,细 胞壁、叶绿体、细胞质、核以及内质网都可以被不同瞬间表达 GFP 融合体标记. 由于 GFP 体积小,可以进入核孔,因此没有融合其它多肽时,GFP 在植物、动物和酵母细胞的 细胞质和核中都有发现(图 1A). 由于融合一些植物基因序列后发现仅在核内有 GFP 荧光,可 以得出结论,融合的那些序列编码核定位蛋白. 在定位于核内的 GFP-植物蛋白融合体中,有 cryptochrome CRY2,一种蓝光光感受器,以及 ROOT HAIRLESS 1 基因,它对初生根根毛的形 成及幼苗的生存有作用. GFP 和一种 geminivirus 运动蛋白的融合揭示了它是一种核穿梭蛋 白
9、. 融合其它未知定位的蛋白,已经揭示了它们在质体、线粒体或是细胞液的区室分布. 一种具 有香叶基-香叶基-双磷酸合成酶活性的蛋白,及一种 NADP 依赖型异柠檬酸脱氢酶,被显示定 位于线粒体中. 噬菌体形 RNA 多聚酶类似物基因的融合体显示一个是定位于线粒体,而另 一个被转运到叶绿体. 通过融合可能的定位信号到 GFP 上,三个核内编码的 RNA 多聚酶 因子都显示定位于质体中. 拟南芥中三个不同编码丝氨酸乙酰转移酶的 cDNA 克隆基于 GFP 融合蛋白定位,被定位于三个不同的区室细胞液、叶绿体和线粒体. GFP 融合体也 验证两个正式被发现于叶绿体中的蛋白:拟南芥 PALE CRESS
10、核基因产物,用于正常的叶绿 体发育,和 AST82,一种硫酸转运体. GFP 融合在判断未知 cDNA 编码蛋白亚细胞定位的成功,引 发了一种命名为“基序罗网“方法的发展.先将随意的 DNA 片段融合到 gfp,然后分离各种在 不同亚细胞区室表达 GFP 的细胞,最后用 RT-PCR 克隆出表达的 DNA 片段. GFP 融合体还可以被用于发现植物细胞在环境刺激下或是发育途径中,一个蛋白是不是从一 个定位转移到另一个定位. phyA 和 phyB 是光感受器的光敏色素家族成员. GFP 被融合到其 编码序列上,通过激发红光,phyA 和 phyB 被转移至核内;红外线处理,能抑制红光造成的光形
11、 态应答,发现 phyB 而非 phyA,由红光引发的运动被抑制了. 类似的,通过与 GFP 融合,欧芹 bZIP 转录因子 CPRF2 的运动也显示受到光敏色素的调控. GFP 还被用于研究植物中核输出 途径及胞间连丝间蛋白的穿梭. GFP 融合在判断一个蛋白的细胞内定位上并不是一种完全正确无误的方法. 由于 GFP 与酶 的融合常常不会抑制酶的活性,因而 GFP 普遍被认为是无害的标记. 然而,一些证据表明在 特定区域的高表达有损于细胞. 例如,Haseloff 等发现,除非 GFP 被隔留在 ER 中,否则很难拿 到高荧光转基因植物株系. 虽然绝大多数在动物细胞中表达 GFP 的报道说明
12、 GFP 表达没有 毒性,但有害性有时仍然被发现.此外,在特定情况下,GFP/蛋白的融合蛋白与野生型蛋白在亚 细胞定位仍有可能有区别. GFP 的存在可能会掩盖住融合蛋白上穿梭序列编码的潜在定位 信号. 尽管大多数真菌与植物的线粒体研究表明,含有定位于线粒体的穿梭序列的信号蛋白 有效地转运到目的细胞器, 但错例仍有时发生. 相反,如果 GFP 融合造成融合蛋白的构型发 生变化,原本在没有 GFP 时或是缺乏某些内源配基时应该被掩盖住的定位信号,会被激活. 另一个问题是,融合目的基因序列与 gfp 可能导致不正常折叠或是编码的融合 GFP 不稳定,因而很难检测到荧光.在正规文献中这种阴性结果很少
13、提起,但私底下一些研究者碰到过获取 不到高亮度荧光蛋白的问题.融合蛋白 N 端的正确折叠被显示会影响 GFP 的 C 端的折叠水 平.例如,麦芽糖结合蛋白的信号序列与 GFP 的融合在大肠杆菌中非正常折叠,而且缺失荧光. GFP 标记区室 GFP 与穿梭序列或是完整蛋白的融合体不仅可以判断特殊分子的定位,还可以用于商讨标记 精细的区室.这些实验的目的可能是为了研究关于一个或多个区室的数量、大小、形状、运 动性、与其它细胞器的结合,以及观察在发育过程中或是环境应答的情况下动态的变化.GFP 定位已经帮助人们观察到以前不可能观察到的植物细胞内的组织结构(图 1、2). 一些研究者有意地去标记核来研
14、究区室. Chytilova 等人设计了含有一个 NLS 的 GFP/GUS 融合体的融合基因,用于获得有标记的核的转基因植物,后者可以用于研究在细胞周期中核的 形态及运动. 通过融合 GUS,增大了 GFP 蛋白的大小,造成了 GFP 在核的滞留. 从 SV40 中 获得的核定位信号(NLS)融合于 GFP 上, 可以获得绿色荧光核的转基因植物(图 1B),但这种 较小的 GFP 融合蛋白在细胞质中仍然可以观测得到.在植物细胞中,其它的区室也已经被标 记,液泡, 过氧化物酶体, 高尔基体,线粒体(图 1C,2D),质体(图 2A,3),细胞骨架,质膜,细胞壁和 ER(图 1D,2C). 用
15、GFP 融合体去标记确定某些细胞结构,如核和细胞壁,能通过和细胞的光显微图像比较而 得到确定.而其它荧光显现出的细胞器或结构的确定则并不总是很明显,当然,需要实验的验 证.一个常用的方法是,用一种特殊的化学染料标记一种容易标记的细胞种类,再用标记后的 图像与绿色荧光的图像进行比较. 举例来说,用线粒体特殊的荧光染料可以验证线粒体的特 殊标记,GFP 和叶绿素自发荧光的红色信号的共定位可以确定叶绿素的定位. GFP 标记的另一种细胞内的“区室“则是植物病毒.激发荧光的病毒穿越胞间连丝,从一个细胞 转移到另一个细胞,这种观察对理解病毒的增殖与传播提供了新的途径.进一步而言,GFP 可 以用于标记病
16、毒蛋白,如运动蛋白,观察病毒编码的蛋白如何与细胞内的组织结合.这一方面 的更多内容可以在近期的文章中找到. 然而,绝大多数亚细胞区室的标记必须通过引入融合 gfp 基因至核内,并须经蛋白转移至所需 的场所.由于一些物种的质体染色体可以转化,出现了一种可行的选择方法. GFP 编码区通过 分子轰击引入烟草或马铃薯的叶绿体,或通过原生质体 DNA 吸收,而得到含有高亮度荧光质 体的转基因植物(图 3). Khan 和 Maliga 将 GFP 编码区融合一种抗生素抗性选择标记到一种 叶绿体 DNA 转化载体,报道说得到有荧光质体的转基因植物.GFP 也可以通过分子轰击或是 叶绿体微注射在叶绿体中瞬间表达. 除了辨别正常植物细胞内区室的特征,区室的标记在分析由于突变或是病理攻击而造成的细 胞功能损伤时非常有用. 例如,带有 GFP 标记 ER 的转基因植物细胞,可以用于观察 ER 在遭 受烟草镶嵌病毒或是豇豆镶嵌病毒的感染后引起的变化.质体的 GFP 标记在细查叶绿素缺 失的突变体植物中应该是相当有帮助,因为用光学显微镜是很难观察不正常的质体. 在植物系统中,区室标记需要进一步研
