第八章_抗生素药物的分析

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1、第八章 抗生素药物的分析第一节 概 述抗生素的概念： 具有抑制或杀灭微生物的一类物质。 抗生素的特征： 生物体在生命活动过程中合成的次级代谢产物。 性质不稳定，易降解、聚合 纯度一般较低 临床上会引起不良反应 临床应用广泛，影响大抗生素药品质量研究的项目： 性状及鉴别试验，含量测定或效价测定，酸碱度 测定，澄明度，水分或干燥失重，安全试验（ 异常毒性），热原，降压物质，无菌。 其他检查：组分、杂质、晶型、比旋度、灰分、 重金属、熔点等。 抗生素药品分析常用的方法： 物理方法:旋光法、紫外、红外、色谱等 化学方法（专属性不强）：功能团反应，鉴别和 含量的测定。容量分析法：酸碱滴定（青霉素 含量测

2、定）和碘量法。 生物学方法：酶反应、微生物法测定效价第二节 抗生素效价微生物检定法一、微生物检定法定义：是利用微生物发育时对某些物质的特殊依赖 性，按这些物质对微生物生长的影响，对他们作 出定量鉴定的方法。微生物检定法可分为三类： 稀释法（dilute method）、比浊法 （turbid compare method）、琼脂扩散法（diffuse method）。与化学方法相比： 优点：1、原理与医疗要求基本一致2、对微生物作用直接反映其抗菌活性 缺点：1、结果是总效价，无法区分多组分2、时间长，有一定误差，操作繁杂二、抗生素标准效价（potency)单位牛津单位:抑制50毫升肉汤培养基中

3、金黄色葡萄球 菌生长的青霉素的最低含量为一个牛津单位. 一个牛津单位相当于0.6ug的青霉素钠盐所具有的 抗生活力，1mg青霉素G钠盐含有1667个牛津单位 ,(IU) （一）稀释单位 (u/ml，u/mg) 将1mg抗生素配成溶液，在一定条件下进行稀释， 对某一细菌能抑制其生长的最高稀释度，即为 1mg抗生素中可含有的单位。（二）重量单位 (u/mg)以抗生物有效成分（即生理活性部分 ）的重量作为抗生素的单位。称重量单 位.。如一个链霉素碱单位的重量为1微 克，一个青霉素G钠盐的单位的重量为 0.6微克。同一种抗生素的各种盐的校价 可根据其分子量与标准盐类进行换算而 得。青霉素G钾盐的理论效

4、价（U/mg）=（U/mg）1类似重量单位:以抗生素盐类纯品的重量为单位。包括无生 物活性的酸根和金属离子。 2重量折算单位以与原始的生物活性相当的纯抗生素实际 重量为一个单位， 3特定单位 以特定抗生素某一批产品的某一重量为一个 单位，经有关国家权威机构认可而定.效价测定的方法： 一、稀释法（dilute method） 二、比浊法 （turbid compare method） 三、琼脂扩散法（diffuse method）一、稀释法原理：用液体培养基逐级将抗生素稀释， 在各管中加入等量的试验菌液，进行培养 ，观察抑制细菌生长的最低抗生素浓度， 再与同法测定的标准品终点作比较，从而 求得被

5、测抗生素的效价。nX=(T/S)*CnX样品效价(U/ml)nT检品液最大稀释倍数nS标准品液最大稀释倍数nC标准品液效价(U/ml)试管编号12345678910稀释倍数 标准品 供试品2 - -4 - -8 - -16 - -32 - +64 + +128 + +256 + +512 + +1024 + +-：细菌被抑制 +：细菌生长X=(T/S)*C=（16/32）*40=20 （U/ml)检测终点判断： 1、试验菌生长完全抑制 2、生长50%抑制 3、指示剂变色 4、电位差的改变 5、菌种的溶血现象等二、比浊法原理：将一定量的抗生素加至接种有试验 微生物的液体培养基内，混匀后，经短期

6、培养（约3-4h），测量培养基浊度，其浊 度与细菌数、细菌群体质量存在直接关系 ，在一定的范围内符合比耳定律。细菌数、细菌群体质量又直接受抗生素效 价的影响。影响因素： 一、影响比浊法的物理因素1、散射现象2、菌液浓度：3、细菌体大小的变化 二、培养基：在没有外加抑制剂的情况下， 菌体的生长受培养基的成分、酸度、培养 温度、通气等条件影响。一般的试验菌是 金黄色葡萄球菌，pH在6.8-7.8。 三、培养：温度、振摇。一般培养时间3小 时，可缩短为2小时。操作流程如图：基本要点： 1 培养条件的控制：试管规格均一 水浴箱 水温均匀，试管按拉丁方排列。 2 细菌生长误差的控制： 3 测量时间的控制

7、：各管应先充分混匀， 将菌液移入比色皿后静止2分钟后测定。三、琼脂扩散法（diffuse method ）即管碟法n管碟法原理:n 抗生素在涂布特定菌的琼脂培养基内扩散，形成 一定浓度抗生素的球型区，抑制试验菌生长，通过透 明培养基观察抑菌圈，抗生素剂量的对数与抑菌圈面 积或直径成正比。在同样条件下将已知效价的标准品 溶液与未知效价的供试品溶液的剂量反应(抑菌圈)进 行比较；当标准品和供试品是属于同一性质的抗生素 时，标准品溶液和供试品溶液对一定试验菌所得的 剂量反应曲线，在一定剂量范围内应互相平行。根据 以上原理，可设计为一剂量法、二剂量法及三剂量法 。从而可以较为准确地测定供试品的效价。抑

8、菌圈的形成nM:抗生素在管中的量nD：扩散系数nT：扩散时间nC：最低抑菌浓度nH：培养基厚度D的影响因素： 抗生素本身结构、分子量等，结构简单者容易扩 散，分子量大的扩散就慢， 杂质：抗生素或培养基中含有杂质，杂质本身也 有扩散系统，看干扰抗生素的扩散，影响抑菌圈 的大小和清晰度。 琼脂含量：含量过多影响抗生素的扩散，过少又 使钢管下陷，影响抑菌圈的大小。 菌种对抗生素的吸附作用： pH影响分子的形式、 温度影响扩散 D增大，r也增大nT的影响：n 一般T增加，r增大，但时间太长影响抑菌圈 清晰度。nM的影响：在一定的范围内，小管内M越大， 抑菌圈直径越大，M还与抗生素的抗菌活性、 浓度、钢

9、管的大小、剂型、辅料等有关。nC的影响：C越小，抑菌圈直径越大，C与菌种 、菌量、培养基、温度等有关nH的影响：培养基增厚，则抑菌圈减小。n操作中要注意：n1试验菌种：挑选合适的敏感菌；用适宜 的菌种保存方法；定期对菌种分离纯化 ；控制菌龄菌量。n2培养基：培养基的成分影响抑菌圈的大 小和清晰度，pH也很重要。一剂量法（标准曲线法）n一剂量法（标准曲线法）原理：在一定 范围内，抑菌圈的直径随抗生素浓度的 增减而增减。并且抑菌圈的直径与抗生 素的对数剂量成线性关系。据此测定抗 生素效价。 Y=a+bX Y:抑菌圈直径 A：截距 B：斜率 X：抗生素浓度的对数。 方法：为了消除平板间的差异，在每一

10、平板的含菌 培养基上放置6个小钢管，相间的3个小管内加入 抗生素标准品的某一浓度（Ck）, 他所产生的抑 菌圈直径平均值为 ，另外3个小管内加入标准品 的中心浓度（Co）,他所产生的抑菌圈直径平均值 为 。令fk = 这样采用自身对照的方法，可以消除平板间的误差 ，使结果更加准确。 f= a+bX 标准曲线的制备：做8个浓度，取24个平皿，分8组 ，每组3个取平均值。fk对X作图。- 检品的效价检定：取3个平皿，每个放6个小管。在间隔的3 个小管内加入抗生素标准品的中心浓度 (Co),另3 个小管内加入估计浓度相当于 Co的检品溶液。测量出fk,从标准曲线中 计算出检品的浓度，在换算出每毫克的

11、 单位数。二剂量法：将抗生素的标准品及检品各稀释成有 一定比例的二种剂量（2：1或4：1），即 高剂量和低剂量，在同一平板上进行对比 ，根据所产生抑菌圈大小来计算检品效价 的方法。nSH:为抗生素标准品高剂量（dS2）所致的抑菌圈直 径nSL：为抗生素标准品低剂量(dS1)所致的抑菌圈直 径nUH：为抗生素检品高剂量(dT2)所致的抑菌圈直径nUL：为抗生素检品低剂量(dT1)所致的抑菌圈直径n n 要求： 1、高剂量抑菌圈直径应为2024nm，个别 可为1824mm，高剂量与低剂量抑菌圈直 径之差应大于或等于2mm。 2、底层琼脂20ml，上层5ml，每一检品所用 平板不少于4个。 3、等距

12、安置小钢管4个，相对角为同一物质 。 4、 为10010%（更精确要求1005% ） 5、标准品与检品同质三剂量法：应用高、中、低三种剂量，在同一实 验条件下比较标准品及检品溶液的抑菌圈 大小，以求得检品效价的方法。S3:为抗生素标准品高剂量（dS3）所致的抑菌圈直径 S2: 为抗生素标准品中剂量（dS2）所致的抑菌圈直径 S1: 为抗生素标准品低剂量（dS1）所致的抑菌圈直径 U3：为抗生素检品高剂量(dT3)所致的抑菌圈直径 U2：为抗生素检品中剂量(dT2)所致的抑菌圈直径 U1: 为抗生素检品低剂量(dT1)所致的抑菌圈直径要求： 1、标准品中剂量抑菌圈直径1518mm 2、高、中、低

13、剂距为1:0.8 3、每一检品不得少于6个平皿 4、每板上等距安放小钢管6个 5、: 10010%（100%5%）三 影响抗生素效价管碟法测定结果的 因素及其控制（一）影响抑菌圈形状的因素与控制1稀释抗生素用的缓冲液的PH值、盐浓度的影 响 .pH值低或含盐浓度高，就会不显抑菌圈或呈卵 圆形抑菌圈。这是因为抗生素溶液的盐浓度高或 pH值过低，可能改变抗生素分子的解离状态， 影响了抗生素对试验菌抑制作用。2制各琼脂培养基菌层，加菌时培养基温度的 影响 3测试用的器材洗净度的影响 4 双碟培养温度的影响 5 其他操作的影响（二）影响抑菌圈边缘清晰度的因素与控制1 试验菌长时间放置菌群中的一些菌株生

14、理特 性有所变化，或是生长速度改变，或对抗生素的 敏感度有所变化，往往出现双圈，抑菌圈的边缘 不清。在检定时菌层培养基中的菌量影响抑菌圈，菌层 培养基中的菌量过低，抑菌圈边缘模糊不清，菌 量过高、使抑菌圈太小并且影响试验菌灵敏度。 因此，在正式检测之前，找出最适菌量。2 培养基的原材料品种与质量，生测用培养基用 的原材料的选择很重要。3调节培养基的pH值或增加适量的盐浓度可使抑 菌圈清晰.4不适当延长双碟的培养时间，使抑菌圈边缘 不清。抗生素效价管碟法测定的操作技术操作分为八步： 1试验菌的纯化与悬液的制备 2 缓冲液、灭菌水与培养基的制备 3标准品、供试品的称量、溶解与稀释 4 双碟的制备及

15、放管 5 滴加药液 6恒温培养 7 测量抑菌圈直径或面积 8 计算 操作流程：四、比浊法与管碟法比较比浊浊法管碟法 优优 点1、快速1、结结果较稳较稳 定2、客观观、精确2、大批量 3、无扩扩散影响 缺点 1、对样对样 品洁净洁净 度 要求高1、扩扩散因素影响较较 大 2、实验实验 要求较严较严2、时间长时间长 （2天) 3、操作繁琐琐,人为为因 素的干扰扰第二节 抗生素类药物的鉴别一、-内酰胺类抗生素的鉴别结构的共同点：1、和内酰胺相邻的碳原子上有一 羧基，2、内酰胺中氮原子相对的碳原子上有一 功能团氨基。 分类：青霉烷类，头孢烯类，碳青霉烯类（硫霉 素），单环-内酰胺（克拉维酸）。鉴别：1

16、、酶法： -内酰胺酶 2、红外吸收光谱法：3000-2800(C-H),3350cm-1(N- H),1800-1600(羰基)，1460-1375（甲基或次甲基 ） 3、紫外吸收光谱法 4、茚三酮反应：是氨基的反应，与茚三酮缩合， 生成蓝紫色化合物。 5、色谱法：薄层层色谱谱后，氯铂氯铂 酸与硫醚醚基反 应应是灵敏度高的显显色试剂试剂 二、氨基糖苷类抗生素 环己醇配基以糖苷键与氨基糖相连。 链霉素，布鲁霉素，卡那霉素，庆大霉素，新霉素。（一）呈色反应 1、茚三酮反应： 2、坂口反应：链霉素水解产物链霉胍特有。链霉胍，8-羟喹啉 分别与次溴酸钠反应，其各自的产物在相互作用生成橙红色化 合物。 3、糖类反应：莫利西反应脱水 -奈酚糖 糠醛 红紫色产物4、埃尔松-摩根：样品在强酸或强碱水解后释放出氨基乙糖，在碱性条件下与乙酰丙酮缩合，形成吡咯样的衍生物，在碱性条件下与对二甲胺基苯甲醛的乙醇及盐酸溶液成红色，在540nm处