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1、生物与化学工程学院仪器分析第四章 高效液相色谱分析法第一节 高效液相色谱仪 第二节 主要分离类型第三节 液相色谱的固定相与流动相第四节 影响分离的因素与分离类型的选择生物与化学工程学院仪器分析第一节 高效液相色谱仪美国安捷伦公司 Agilent 1200 生物与化学工程学院仪器分析第一节 高效液相色谱仪美国戴安公司 UltiMate3000生物与化学工程学院仪器分析第一节 高效液相色谱仪一、 高效液相色谱仪结构流程 二、 高压输液系统三、 梯度淋洗装置六、 液相色谱检测器五、 分离系统四、 进样系统生物与化学工程学院仪器分析第一节 高效液相色谱仪储液瓶高压泵进样器色谱柱检测器废液一、 高效液相
2、色谱仪结构流程 高压输液泵、高效分离住、高灵敏度检测器生物与化学工程学院仪器分析第一节 高效液相色谱仪二、 高压输液系统（高压泵）要求： 输出压力高； 平稳、脉冲小； 流量稳定可调； 耐腐蚀。机械往复柱塞泵结构图生物与化学工程学院仪器分析第一节 高效液相色谱仪三、 梯度淋洗装置在液相色谱中,可以通过改变流动相的组成、极性来改善分离和调节出峰时间。生物与化学工程学院仪器分析第一节 高效液相色谱仪两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入混合器，混合后进入色谱柱。一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入混合器中混合。高压梯度(外梯度)低压梯度(内梯度)生物与
3、化学工程学院仪器分析第一节 高效液相色谱仪通过改变流动相的组成来调整组分 的k值，改变分离因子值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。梯度洗脱梯度洗脱 的特点改善分离, 加快分析速度；改善峰形, 减少拖尾;可能引起基线漂移。生物与化学工程学院仪器分析第一节 高效液相色谱仪四、 进样系统六通阀进样 装置生物与化学工程学院仪器分析第一节 高效液相色谱仪内径：16 mm，柱长：550 cm；柱填料粒径：5 10m 为保护色谱柱，通常在柱前加一支填料与色谱柱相同的保护柱。 五、 分离系统（色谱柱）生物与化学工程学院仪器分析第一节 高效液相色谱仪六、 液相色谱检测器类 型紫外检测器示差折光检测器荧光检测
4、器电化学检测器电导检测器生物与化学工程学院仪器分析第一节 高效液相色谱仪（一）、紫外检测器应用最广泛的检测器基本原理：试样组分对特定波长的紫外光具有选择性的吸收，吸光度与试样组分浓度之间的定量关系符合郎伯-比耳定律。优点： 灵敏度高，线形范围宽； 死体积小； 波长可选； 对流速和温度变化不 敏感； 可用于梯度洗脱。缺点： 无紫外-可见吸收组分不响应； 流动相选择受一定限制。生物与化学工程学院仪器分析第一节 高效液相色谱仪一些常用溶剂的紫外截止波长溶剂二硫 化碳氯仿四氢 呋喃苯乙睛甲醇水紫外截止 波长 /nm380245212210190205187生物与化学工程学院仪器分析第一节 高效液相色谱
5、仪(a) 可变波长紫外检测器(b) 二极管阵列检测器生物与化学工程学院仪器分析第一节 高效液相色谱仪两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器峰纯度 检验生物与化学工程学院仪器分析第一节 高效液相色谱仪（二）、示差折光检测器通用型检测器基本原理：连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光系数差值，该值与试样池流动相中的组分浓度成正比。每种物质具有不同的折光指数。生命科学中各类糖类化合物，没有紫外吸收，一般要用示差折光检测器。 生物与化学工程学院仪器分析第一节 高效液相色谱仪缺点： 灵敏度低； 对温度敏感； 不能用于梯度洗脱。生物与化学工程学院仪器分析第一节 高效液相色
6、谱仪（三）、荧光检测器专用型检测器基本原理：在一定的条件下，荧光强度与流动相中的组分的浓度成之比。对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。生物与化学工程学院仪器分析第一节 高效液相色谱仪特点：高灵敏度；高选择性；可用于梯度洗脱。生物与化学工程学院仪器分析第二节 主要分离类型一、液-固吸附色谱 二、液-液分配与化学键合相色谱三、离子交换色谱四、离子对色谱五、空间排阻色谱六、亲和色谱生物与化学工程学院仪器分析第二节 主要分离类型一、液-固吸附色谱流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等。颗粒度较小， 5-10m分离机理
7、：流动相中的溶质分子(X)与溶剂分子(S)在固体吸附剂上竞争吸附的结果。生物与化学工程学院仪器分析第二节 主要分离类型下标M、s分别代表流动相和固定相，n代表被吸附的溶剂分子数；K代表吸附平衡常数。吸附平衡常数K不等于分配系数。K值越大，保留时间越长，分配系数大。 适用对象：相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。生物与化学工程学院仪器分析第二节 主要分离类型二、液-液分配与化学键合相色谱（一）、液-液分配色谱固定相与流动相均为液体（互不相溶）。基本原理：组分在固定相和流动相上的分配。与气相色 谱中气-液 色谱比较 ？改变流动相的组成来 改善分离效果。K不仅与固
8、定相的种 类有关，也与流动相 的种类有关。生物与化学工程学院仪器分析第二节 主要分离类型固定相极性流动相极性正相分配色谱（正相柱）组分极性越大，保留 时间越长；使用极性 化合物的分离。反相分配色谱（反相柱）固定相极性 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)常用溶剂的极性顺序生物与化学工程学院仪器分析第三节 液相色谱的固定相与流动相1、尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。选择流动相时应注意的问题2、避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或
9、损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。生物与化学工程学院仪器分析第三节 液相色谱的固定相与流动相3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。4、流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。生物与化学工程学院仪器分析第四节 影响分离的因素与分离类型选择一、影响分离的因素二、分离类型的选择生物与化学工程学院仪器分析第四节 影响分离的因素与分离类型选择一、影响分离的因素速率方程溶质在液相流动相 中的扩散系数，约 为气相中扩散系数 的万分之一生物与化学工程学院仪器分析第四节 影响分离的因素与分离类型选择修正的速率方程：A. 降低颗粒度
10、大小，填充均匀；B. 减小液膜厚度；C. 选择粘度小的溶剂；D. 选择较低的流动相流速。提高柱效 途径生物与化学工程学院仪器分析第四节 影响分离的因素与分离类型选择二、分离类型的选择根据分析目的、试样性质、化合物的结构生物与化学工程学院仪器分析气相色谱与高效液相色谱的比较气相色谱高效液相色谱1. 只能分析挥发性物质，只能分析 20%的化合物2. 不能用于热不稳定物质的分析3. 用毛细管色谱可得到很高的柱效4. 有很灵敏的检测器如ECD和较灵敏的通用检测器（FID和TCD）5. 流动相为气体，无毒，易于处理 6. 运行和操作容易 7. 仪器制造难度较小1. 几乎可以分析各种物质 2. 用于热不稳定物质的分析 3. 色谱柱较短，柱效较低4. 没有较高灵敏通用检测器 5. 流动相有毒，费用较高 6. 运行和操作比GC难一些 7. 仪器制造难度大
