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1、实验1 大肠杆菌的培养和分离实验目的：n1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基 进行细菌培养的操作。n2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养 基本进行细菌的划线培养。n3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。 一、基础知识 n(一)微生物:1.特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常 要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚 至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能 进行光合作用.2.微生物包括五类病 毒细 菌放线菌真 菌原生动物(二)培养基n1.分类(按物理形态分)n(1)液体培养基n(2)固体培养基常用的固体培养基:琼脂固体培养基. 微生物在固体培养 基 表面生长,可以形成 肉眼可
2、见的菌落.2.培养基内所含的基本物质n(1)水n(2)碳源 n(3)氮源n(4)无机盐n(1)pH值n如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微 碱性n(2)特殊营养物质- ?n如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生 素n(3)氧气的含量n如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件3.培养基内所需的其他条件生长因子(三)无菌技术n1、获得纯净培养物的关键: n2、无菌技术 的四个方面(参看教材20页)n3、消毒与灭菌 (1)消毒：概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体 表面或内部一部分对人体有害的微生物。包括芽孢 和孢子吗？方法:煮沸消毒法巴氏消毒法:如牛奶的消毒化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸
3、、煤酚皂溶液等紫外线消毒(不包括芽孢和孢子)防止外来杂菌的入侵（2）灭菌概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的 微生物，包括芽孢和孢子。方法：a 灼烧灭菌 b 干热灭菌 c 高压蒸汽灭菌a.灼烧灭 菌微生物的接种工具 (接 种环、接种针)或其 他金属用具直接在火 焰的充分燃烧层灼烧注意适用范围b.干热灭菌 160170 ；12h能耐高温的需要保持干 燥的物品( 玻璃器皿)c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121 15-30min通常用于培养基的灭菌二、实验操作n（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基n计算称量溶化灭菌倒平板n（二）纯化大肠杆菌n接种方法有：n平板划线法和稀释涂布平板法n（三）将接种
4、后的培养基和一个未接 种的培养基放入37恒温箱中培养 12h和24h后，观察并记录三、课题延伸：菌种的保藏n1、斜面保 藏n （临时保存 ）n2、甘油保 藏（长期保存 ）实验1：大肠杆菌的培养和分离设备及用品：灭菌锅或高压锅、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈 、直径90mm的培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒 温培养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套 、装有酒精棉球的广口瓶、镊子、有棉塞的试管（ 15mm120mm）5支 实验材料： (1)50mlLB液体培养基：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g 、NaCl 0.5g、加水50ml。 (2)大肠杆菌菌种斜面 (3)空白斜面实验步骤n(
5、1) 灭菌：将配制好的50mlLB液体培养基和50mlLB液 体培养基分别装入两个250mln的三角瓶中，加上封口膜，用高压锅进行灭菌。n(2) 制平板：在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在4 个培养皿中，使培养基铺平皿底部，待凝，使之形成 平面。n(3)接种扩大培养：靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到 三角烧瓶的液体培养基中，三角烧瓶在37摇床振荡 培养12h。n(4) 划线分离：将摇床上培养12h的菌液在固体培养基 的平板上连续划线，然后将盖好的培养皿倒置，放在 37恒温培养箱中进行培养。n(5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环 取出，再用划线法接种在空白斜面上，在37下培养 24h
6、, 4冰箱保存。单菌落实验讨论 实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？n实验完成后，所有接触过细菌的器皿都必须 先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可 能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有 害菌体影响人畜健康，也污染环境，因此必 须高压灭菌。使用后的废弃物也要高压灭菌 后再抛弃。对于取样器的取样头，通常是灭 菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤纶30 min ,再用清水洗净，仍可再用。封口膜也可 再用。无菌技术的四个方面n（1）对实验操作空间、操作者的衣着和 手进行清洁和消毒 ；n（2）将培养器皿、接种用具和培养基等 器具进行灭菌 ；n（3）为避免周围微生物污染，实验操作 应在酒精灯火焰附近旁
7、进行；n（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围 物品相接触。 (三)无菌技术返回倒平板讨论: n(1).培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒 平板。你用什么办法来估计培养基的温度？n(2).为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？n(3).平板冷凝后，为什么要将平板倒置？n(4).在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与 皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什 么？提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降 到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基 。 答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的 湿度也比
8、较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好 地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生， 因此最好不要用这个平板培养微生物。返回1、平板划线法n(1).为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种 环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？n(2).在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？n(3).在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一 次划线的末端开始划线？讨论:答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的 微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划 线结束后，接种环上残留
9、的菌种，使下一次划线时，接种环上 的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加， 使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束 后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污 染环境和感染操作者。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次 从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增 加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。返回2.稀释涂布法 :n(1)系列稀释操作:涂布平板操作提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培 养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要 在酒精灯火焰周围
10、；等等。n讨论:涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合 平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2 步应如何进行无菌操作？返回返回菌落：n单个或少数细菌在固体培 养基上大量繁殖时，就会 形成一个肉眼可见的，具 有一定形态结构的子细胞 群体，叫做菌落。n不同的细菌的菌落特征不 同n菌落是鉴定菌种的重要依 据。(2)碳源 可作为碳源的物质有:含碳无机物: 、 、含碳有机物：蛋白质 脂肪酸返回不同微生物所利用的碳源不同 a.异养型微生物的碳源为 b.自养型微生物的碳源为碳酸盐碳酸氢盐二氧化碳 糖类（主要）含碳有机物（有机碳） 含碳无机物（无机碳）(3)氮源可作为氮源的物质有:含氮无机物： 、 、 、含氮有机物：蛋白胨 牛肉膏尿素返回固氮微生物所利用的氮源是氮气氨气硝酸盐氨盐氮气
